Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Domates Analyzer: İki boyutlu Objects Doğru ve detaylı Morfolojik ve Kolorimetrik Veri Toplama Faydalı Yazılım Uygulaması

Published: March 16, 2010 doi: 10.3791/1856

Summary

Domates Analyzer (TA), tekrarlanabilir ve doğru bir şekilde, iki boyutlu şekiller ve renk niteliklerini rakamlarla. Domates meyve, yüksek kaliteli dijitalleşen resimler, morfolojik ve renk analizleri bu yazılım aracılığıyla üretilen verileri kullanarak bu görüntüleri ve çeşitli uygulamalar elde etmek için bir adım-adım yordamı açıklanmıştır.

Abstract

Ölçüm objektif ve tekrarlanabilir bir şekilde sebze ve meyve bitkileri meyve morfolojisi ve renk özellikleri, bu özelliklerin ayrıntılı fenotipik analizler için çok önemlidir. Domates Analyzer (TA), yarı otomatik ve tekrarlanabilir bir şekilde 1,2 iki boyutlu şekli ile ilgili 37 niteliklerini ölçen bir yazılım programıdır . Girinti ve meyve alanları distal ve proksimal ucunda açıları gibi, bu niteliklerin çoğu elle ölçmek için zor. Temel Ölçme, Meyve Şekli Endeksi, blokluluk, homojenlik, proksimal Meyve Sona Şekil, distal Meyve Sona Şekil, Asimetri, İç Eksantriklik, enlem Bölüm ve Morfometri: nitelikleri yazılım içinde on kategoride düzenlenmektedir. Son kategori, ön bilgi ne şekil nitelikleri önceden belirlenmiş kavramları ne gerektirir, bu nedenle morfometrik analiz öznitelik analizine göre daha yüksek verimlilik analizleri adapte olabilir tarafsız bir seçenek sunuyor. TA da, taranan görüntülerdeki toplamak ve renk ölçümleri, renk standartları 3 kullanılarak kalibre cihazları tarama izin vermek için tasarlanmıştır renk testi uygulaması sunmaktadır.

TA, şekil niteliği, morfometrik ve renk verileri verme ve analiz için çeşitli seçenekler sağlar. Veri toplu modunda bir excel dosyası (bir defada 100 den fazla görüntü) ihraç ya da ayrı ayrı görüntü olarak ihraç edilebilir. Kullanıcı (standart sapma dahil) her bir görüntü, ya da görüntü üzerinde her nesne için özellik değerlerini görüntüleyen bir çıkış nesneleri için her öznitelik için ortalama görüntüler çıktı arasında seçim yapabilirsiniz. TA, domates, meyve şekli Kantitatif Sürekli Loci (QTL) yanı sıra derinlemesine analizler bitki morfolojisi üzerinde anahtar meyve şekli genlerin etkisi performans indentifying ve doğrulanması için değerli ve etkili bir araç olmuştur. Ayrıca, TA, nesnel olarak çeşitli şekil kategoriler halinde meyve sınıflandırmak için kullanılabilir. Son olarak, diğer bitki türlerinin yanı sıra diğer bitki, yaprak ve tohum gibi organlar meyve şekil ve renk özellikleri TA ile değerlendirilebilir.

Protocol

Domates Analyzer (TA) yazılımı, belirli bir boyut ve görüntü çözünürlüğü inç başına nokta (piksel) (dpi) olarak ölçülür nesneleri tanımak üzere tasarlanmıştır. Yazılım otomatik olarak taranan bir görüntü meyve sınırlarını belirler. Nesne sınır kontur izleme, bir görüntü, bir nesnenin sınır komşu noktaları açıklayan bir liste sonuçları ile belirlenir. Tüm meyve şekli ölçümleri sınırları göre hesaplanır. Renk testi modülü "Domates Analyzer Renk Testi" yazılım tarafından tanınan sınırlar içinde renk parametreleri ölçmek için tasarlanmıştır. R (kırmızı), G (yeşil) ve B (Mavi): RGB renk alanı renk ölçümleri dayanır. Renk test modülü, her bir piksel için ortalama RGB değerleri tarafından alınan ve daha sonra L kullanır CIELAB renk alana tercüme *, a *, b * renk insan görsel algı yakınlaştıran bir şekilde tanımlamak için. Renk test modülü, Hue ve Renk renk tanımlayıcılar a * ve b dayalı hesaplar *.

Domates meyve ve TA yazılım paketi kullanarak morfolojisi ve renk özniteliklerini sonraki yarı otomatik analiz sayısallaştırılması için bir adım-adım protokolünü tarif edilir. Protokolü sekiz adımları ayrılır: öznitelikleri TA Renk Testi, 5 1) Seçme ve bitki materyali, 2 hazırlık) Görüntü toplama, 3) Yazılım kurulumu, 4) Görüntü analizi ve kalibrasyon), Manuel ayarı, 6) User- tanımlı ayarlar, 7)) veri analizi örnekleri kaydetme ve veri ihracat ve 8.

1. Seçme ve bitki materyali hazırlanması

  1. Meyve, kuru ve temiz olmalıdır.
  2. Etli meyve olgunlaşmış meyve keserken yumuşama şeklini deforme olmasına neden olabilir çünkü olmamalıdır.
  3. Meyve, keskin bir dişli bıçak ya da yeni bir jilet ile kesin. Analizi ve değerlendirilmesi için özniteliklerini türüne bağlı olarak, meyve merkezi aracılığıyla ya da enine boyuna kesilmiş olmalıdır. Renk analizi enine boyuna veya meyve gibi belirli özellikleri vurgulamak için tasarlanmış diğer bölümleri kesmek için uygulanabilir.
  4. Doku veya kağıt havlu ile blot meyve çok sulu meyvenin iç kısmında kurulayın.

2. Resim koleksiyonu

  1. Meyve ve kesme yüzü aşağı tarayıcı yer kesin. Yukarıda bir cetvel ve meyve altında bir etiket yerleştirin. Cetvel doğru tarama çözünürlüğü seçili olduğunu doğrulamak için kullanılan ve meyve özniteliklerin doğru ölçümü için önemlidir. Yüksek verimli veri analizi için, bir seferde sadece bir bitki (ya da genotip) meyve taramak ve aynı tarama ya boyuna veya enine kesilmiş değil, ikisinin bir karışımı meyve tarama çok önemlidir. Yeri meyveler birbirine yakın, ancak komşu meyve dokunmaktan kaçının. Ayrıca tarayıcı meyve arasında büyük boş alanlar kaçının. Nesneleri birbirinden çok uzak, görüntü TA analizi için önce Adobe Photoshop ya da GIMP gibi görüntüleme yazılımı kullanılarak manipüle olmalıdır.
  2. TA yazılım doğru boyutunu ölçmek için görüntü çözünürlüğü kullanır, tarama çözünürlüğü uygun seçimi, daha sonra analiz için önemlidir.
    1. Nesnelerin 1 ila 8 cm, bir kural olarak, 200 veya 300 dpi (piksel / inç) tarayın. Eşyaları> 8 cm ise, 100 dpi çözünürlükte tarama. Gibi tohum olarak (<1 cm) çok küçük nesneler için, 750 dpi veya daha yüksek tarama. Toplu analizi planlanan (aşağıya bakın) ve meyve büyüklüğü farklı bitkiler arasında son derece değişken olduğunda, aynı deneyi için toplanan tüm görüntüler için bir tarayıcı çözünürlük ayarı seçmek için uygundur.
    2. Meyve <8 cm Renk testi için tarayıcı, 200 dpi çözünürlüğü ayarlamak. Meyve> 8 cm, 100 dpi çözünürlükte tarama. Ayrıca, tarayıcı kullanılabilir renk en yüksek sayıda çıkış görüntü boyutu ayarlayın.
  3. Nesneler analizi ile engel olacak gölgeleri önlemek için siyah veya çok koyu bir arka plan ile taranmalıdır. Tüm ışık ekrandan kısıtlı olduğu için karanlık bir arka plan tarayıcı üzerinde bir karton kutu koyarak elde edilebilir. Eğer beyaz bir arka plan uygulama, karanlık bir arka plan kullanım için optimize edilmiş olduğundan, TA işlevi başarısız olur.
  4. Görüntü, büyük boş alanlar önlemek için ilk tarama (görüntü kaydetmeden önce) sonra kırpılmış olmalıdır. Bu aşamada görüntü kırpılmış değilse, önce TA analizi gibi Adobe Photoshop ya da GIMP gibi görüntüleme yazılımı kullanarak kırpılır olmalıdır.
  5. Renk analizleri için, tarayıcı RGB değerleri evrensel L çevirmek için kullanıcı düşünülüyorsa, kalibre edilmesi gerekir *, a * ve b * ölçekli. Renk denetleyicisi tarama (Şekil 1), meyve tarama sırasında veya öncesinde meydana gelmelidir. Taranan renk denetleyicisi meyve görüntü olarak aynı klasöre kaydedilmesi gerekir. Tarayıcılar renk d yakalamak nasıl farklı olduğundan Tarayıcı kalibrasyon gerekliata ve ışık kaynağı tekrar kullanımı ile zamanla değişebilir.
    1. Renk standartları elde edilmesi ve tarama. Renk standartları geniş ilgi kırpma gözlenen renk seçilmelidir. Bu örnek için, standart bir 24-renk şeması (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Şekil 1) seçti. Meyve tarama olduğu gibi renk denetimi tarayın. Tarayıcı kalibrasyon bölüm 4.7 'de açıklanmıştır.
  6. Taranan görüntüyü bir JPEG dosyası olarak kaydedin.
    Not: resim koleksiyonu adım sırasında tarayıcı nesneleri yerleştirirken dikkatli ve hassas olun. TA meyve analiz ederken nesneleri hizalanır daha iyi, daha az manuel ayar gerekli olacaktır. Düşük ve yüksek kaliteli görüntüler örnekler Şekil 2'de gösterilmiştir.

3. Yazılım kurulumu

  1. Domates Analyzer (TA) 2.2.0.0 sürümü indirilebilir http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm . Domates Analyzer Kullanım Kılavuzu ve Domates Analyzer Renk Testi Kılavuzu Bu web sitesinden de mevcuttur.
  2. TA, bir Windows işletim sistemi (sürüm 2000 veya üstü) gerektirir.

4. Görüntü analizi ve kalibrasyon TA Renk Testi

  1. Görüntüleri ile sabit disk klasör ve "Belgelerim" klasörüne veya uzak bir sunucuda konulmalıdır. Aksi takdirde, TA orijinal görüntü olarak aynı klasörde düzeltilmiş görüntüleri kaydetmek olmaz. Uzantısı ile düzeltilmiş görüntüler. Tmt orijinal ile aynı klasörde olduğunu jpg görüntüleri (adım 6.1.1 'e bakınız) emin olun.
  2. Başka herhangi bir yazılım uygulaması olarak TA program simgesine çift tıklayarak başlatın.
  3. Kullanıcı dpi ve ölçü birimleri tarafından uygun ayarları "Ayarlar" menüsünden "Tarayıcı DPI" seçilerek ayarlamanız gerekir. Dpi ayarı boy ölçümleri (yükseklik, genişlik, çevre, bölge) doğru olduğunu bu yüzden resim dosyası olarak aynı olmalıdır. Iletişim kutusunda "kullanılmış Birimleri" veri çıkış birimleri (cm, mm, ya da piksel) belirler. Aynı iletişim kutusunda, parlaklık nesnelerin görece koyu ayarlanması gerekebilir.
    Not: DPI ve birimler de manuel ayarlar yaptıktan sonra veya görüntü analizi sonra ayarlanabilir.
  4. Kullanıcı, "Ayarlar" menüsünden "Ölçme Kaydedildi" seçme ölçülebilir nitelikleri seçebilirsiniz. Bu analiz sırasında veya sonrasında herhangi bir zamanda yapılabilir. Nitelikler on kategori (yani Temel Ölçme, Meyve Şekli Endeksi, blokluluk, homojenlik, Proksimal Meyve Sona Şekil, Distal Meyve Sona Şekil, Asimetri, İç Eksantriklik, enlem Bölüm ve Morfometri) gruplandırılmıştır. Bireysel özellikler ya da bütün bir ölçü grubu, grup veya öznitelik tıklayarak seçili veya seçili olabilir. Bir ölçüm grubun tüm özellikleri "+" tıklayarak gösterilebilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi ekranın sağ alt köşesinde bir pencerede kategorisine göre seçilen nitelikleri görüntülenir.
  5. Başlamak için, "Aç görüntü" butonuna tıklayın ve açılan iletişim kutusunda görüntü dosyası seçin. Seçilen görüntünün sol pencerede görünecektir.
  6. Açılan görüntüyü analiz için "Analyze" butonuna tıklayın. Tamamlandığında, her meyve çevre sarı bir çizgi ile vurgulanır ve veri sağ alt veri penceresinde görüntülenir. Yazılım otomatik olarak böyle bir cetvel ya da etiket olarak çok büyük ya da küçük nesneleri, seçimini kaldırmak. Seçili nesneler mavi bir çizgi ile vurgulanır. Ek meyveler, resmin üzerine sağ tıklayarak seçili olabilir. Sadece sarı belirtilen öğeleri veri penceresi görüntülenir ve ihraç edilecek (Şekil 3). Mavi belirtilen öğeler analizler dahil olmayacaktır. Bireysel nesneleri fare ile sol tıklayarak sağ üst pencerede görüntülenir.
    Not: Renk test modülü verileri, sağ alt pencerede gösterilmemiştir .
  7. Renk analizi için renk denetleyicisi analiz edin.
    1. Renk skalası ve toplama L *, a *, b * değerleri taranan renkli denetleyicisi görüntüsü açın ve meyve için açıklandığı gibi analiz. TA analiz etmek için bir nesne (sarı sınırı) olarak her yama tanır emin olun. Standart bir renk denetleyicisi kullanıyorsanız, yazılım karanlık bozkırlarında tanımak mümkün olmayabilir. Bu renk kalibrasyon dahil olmayacaktır. Ayarlar menüsü altında, "Renk Testi" seçeneğini seçin. Iletişim kutusu açılacaktır. Düzeltme değerleri eğimi (sol kutuları) ve y kesişim noktası (sağ kutuları) için 0 için 1 olarak ayarlanır emin olun. Minimum mavi değeri 0 olarak ayarlanır ve 1 ve 2 parametreleri göz ardı edilebilir. Renk testi iletişim kutusu içinde analiz düğmesine tıklayın. Inci kaydetmek için yeni bir pencere görünecektirEXCEL açılabilir bir "CSV" bir belge olarak e çıktı. Veri dosyası için bir ad ve dizin belirtin. Renk tonu ve her renk yama için kroma ve hesaplamalar; L *, a *, b * değerleri; çıkış veri dosyası RGB değerleri içerecektir.
    2. Kalibrasyon için düzeltme değerleri belirlenmesi. Arsa L *, a *, b * değerleri her renk renk denetleyicisi üretici veya Tablo 1'de mevcuttur kolorimetre değerleri L *, a * ​​ve b * karşı yama için. Regresyon denklemi belirlemek ve her bir parametre için eğim ve y kesişim kaydetmek. Iletişim kutusunda, eğimi ve y kesişim değeri L *, a * ve b işareti ters ters girin *. Bu değerler "Renk Testi" ayarları için düzeltme değerleri olarak kullanılır.
  8. Renk testi kullanıcı seçilen renk tonu değerleri belirlenen sınırlar içine düşen piksel oranı (%) rapor iki parametre tanımlamanızı sağlar. Domates analizi için, örneğin, istenmeyen sarı ve yeşil-sarı et rengi karşılık gelen parametre 1 için alt ve üst değerler sırasıyla 70 ve 100. Parametre 2 için alt ve üst değerler 0 ile 50 ve istenilen kırmızı renk karşılık gelir. Bu değerler için ayarları kaydedin. Bu değerler, program kapatılıncaya kadar analiz edilen tüm görüntüleri geçerli olacaktır. Taranan görüntüler için, "C 2 ° aydınlatıcı" seçin. "Aydınlatıcı D65 10 °" seçeneği sadece doğal ışık elde edilen görüntüler için uygulanır.
  9. Sonuçlar görselleştirme (bkz. Şekil 3): sağ alt veri penceresi veri her satır görüntü belirli bir nesneye karşılık gelir. Veri, görüntü nesneleri olarak aynı sırayla görüntülenir. Ilk satırı, sol üst köşede bulunan nesne için değerlerini görüntüler ve son veri satırını nesne için resmin sağ alt köşesinde değerlerini görüntüler. Bir satırda, sağ üst pencerede ilgili meyve görüntülemek için tıklayın. Alternatif olarak, bir meyve üzerine tıklayın ve ilgili veri satır vurgulanır. Sağ alt pencerede öznitelik sekmesini tıklayarak nitelik özellikle her meyve için ölçülen nasıl görüntülemek mümkün. Örneğin, distal ucu açısı üzerine tıklayarak sol pencerede meyve yazılım tarafından ölçülen açı olacaktır. Bu özellik, daha doğru bir ölçüm için manuel ayar gerektiren nesneleri belirlemek için çok yararlıdır.
    Şekil 4 Renk test modülü ile analiz etmek için bir görüntü gösterir. Ancak, sonuçlar veri penceresi görülmemektedir. Analiz kaydedildikten sonra Veri sadece bir Excel dosyasını ulaşılabilir.

5. Özniteliklerin Manuel ayar

Bazen meyve ve proksimal ve distal uçları sınır TA tarafından doğru bulunmaz. Ayrıca, meyve, tarayıcı üzerinde bir açıyla yerleştirilir, görüntü doğru ölçümler elde etmek için ayarlanabilir olmalıdır. Bu ve diğer özellikler ilk analiz yapıldıktan sonra görüntülerin manuel ayar ile düzeltilebilir. Mevcut ayarları "gözden geçirin" menü butonu altında görünür ve şunlardır: Döndür, Sınır, Proksimal sonu, distal sonu, Auto-döndürmek Elips ayarlayın, Distal Çıkıntı ayarlayın, pericarp Sınır, Varsayılan pericarp Sınır ayarlayın.

Not: ayarlamalar yapılacak ise, ilk dönme hareketini takip, sınır ayarlamak. Diğer tüm ayarlamaları bu iki değişikliklerin ardından herhangi bir sırada yapılabilir. Farklı bir ayar seçilir kadar gözden geçirin menüsü altında seçilen bir ayar seçili kalır. Bu kullanıcı, dilim resmin üzerine tıklayarak ve gözden geçirin butonuna tıklayarak dilim bir dizi aynı ayarı yapmak için izin verir. Aşağıda manuel ayarlamalar, farklı meyve özellikleri hakkında ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

  1. Sınır
    1. Sol pencerede meyve sol tıklayın. Bu sağ üst pencerede görünecektir.
    2. "Gözden geçirin" düğmesi yanındaki oka tıklayın ve sağ üst pencerede açılan listesinde "Sınır" ı seçin. Yanlış sınır başlangıç ​​noktası ve bitiş noktası üzerine tıklayarak sol tarafından değiştirilebilir sınır konumu seçin. Sonuç olarak, ayrılmış sınır silinecektir.
    3. Yeni bir sınır eklemek için, başlangıç ​​noktasından bitiş noktasına doğru sol tıklayın. Istenilen kontur takip tıklayarak devam edin. Sağ tıklayarak bir önceki değişiklik geri alınır. Çoklu değişiklikler ardışık sağ tıklama ile geri alınabilir.
    4. Yeni sınır onaylamak için, "Enter" tuşuna basın. Aksi takdirde, bu işlemi iptal etmek için "Esc" tuşuna basın.
    5. Orijinal sınır ayarı geri dönmek için "Reset Sınır" üzerine tıklayın.
  2. Döndürün. Bu özellik, bir nesnenin tamamen dikey değilken kullanılır.
    1. Sol pencerede uygun meyve tıklayın. Bu sağ üst pencerede görünecektir.
    2. "Gözden geçirin" düğmesi yanındaki oka tıklayın ve "Döndür" seçeneğini seçin.Listede aşağı doğru açılan menüden.
    3. Bir eksen, sağ üst pencerede görüntülenir. Ekseni sonunda yeşil kare sürükleyin ve meyve göre dönecektir.
    4. Pencerenin içinde çift tıklayın ya da bitirmek için "Enter" tuşuna basın.
    5. Orijinal uyum dönmek için "Reset Dönme" üzerine tıklayın.
  3. Proksimal ucuna ayarlayın. Proksimal ucunun pozisyonu bir hata varsa, bu özelliği elde edilen ölçümler hatalı olacaktır. Sağdaki pencerede görünecek şekilde ayarlamalar gerektiren bir meyve seçin. Sonra, "Proksimal meyve bitiş şekli" sekmesi ve seçilmiş meyve altında veri çıkış bölümünde "Proksimal açısı mikro veya makro" seçeneğini seçin. Proksimal açıları şimdi soldaki resimde her meyve için gösterilen olacaktır. Bu şekilde, alışılmadık açıları tespit edilebilir. Proksimal ucunun konumunu değiştirmek için, şu adımları izleyin:
    1. Sol pencerede istenen meyve tıklayın. Bu sağ üst pencerede görünecektir.
    2. "Gözden geçirin" düğmesi yanındaki oka tıklayın ve açılan listeden "Proksimal End" seçeneğini seçin.
    3. Sağ üst pencerede tıklatın ve tepe göstergesi doğru konuma sürükleyin.
    4. Çift tıklayın ya da bitirmek için "Enter" tuşuna basın.
  4. Distal ucu ayarlayın. Nesnenin distal uç pozisyonda elle de değiştirilebilir. Verimli distal ucu ayarlamaları gerekir meyve bulmak için, proksimal sonu için aynı prosedürü izleyin.
    1. Sol pencerede istenen meyve tıklayın. Bu sağ üst köşesinde görünecektir.
      "Gözden geçirin" düğmesi yanındaki oka tıklayın ve açılan listeden "Distal End" seçeneğini seçin.
    2. Sağ üst pencerede tıklatın ve tepe göstergesi doğru konuma sürükleyin.
    3. Çift tıklayın ya da bitirmek için "Enter" tuşuna basın.
  5. Distal ucu çıkıntı. Bu fonksiyon, kullanıcının uç sınırında uç noktalarını tanımlamak için izin verir.
    1. "Meyve Distal Sona Şekli" sekmesi altında, etiketli sütunda "Distal Sona Çıkıntı" seçeneğini seçin ve ayarlamak için nesneyi seçin.
    2. "Gözden geçirin" düğmesi yanındaki oka tıklayın ve açılan menüden "Distal Çıkıntı ayarla" seçeneğini seçin.
    3. Sınır boyunca istenilen pozisyonlar için görünen noktaları sürükleyin.
    4. Bitirmek için Enter tuşuna basın. Ucu alan ve yeniden hesaplama ucu alan kesim gösteren bir çizgi belirir. Distal End Çıkıntı sütunda görünür. Ucu alanında istenilen konumda değilse, "gözden geçirin" butonu altında "Reset Distal Çıkıntı" seçilerek, ilk konumlarına puan sıfırlanır. Bir ipucu alanı bulunan fakat bulunmaması gerekiyorsa, "gözden geçirin" butonuna "Distal Çıkıntı ortadan kaldırın" seçilerek "Distal Sona Çıkıntı" sütun için 0.0 değeri ile sonuçlanan, meyve alt noktalar hareket edecektir.
  6. Otomatik döndürmek. Bu fonksiyon, otomatik olarak aynı yöne bakacak şekilde sivri ucu ile uyumlu hale getirilmesi ve böylece özellikle domates tohumu için geliştirilmiştir. Şu anda, meyve gibi diğer nesneler üzerinde otomatik döndürme işlevi çalışmıyor.
  7. Elips ayarlayın. Bu fonksiyon, kullanıcının yeniden boyutlandırmak ve / veya iç meyve alanları tanımlamak için iç elips taşımak sağlar. Bu nitelik, İç Eksantriklik fonksiyonu ve TA Meyve Şekli Endeksi İç özniteliği için kullanılır.
    1. İç Eksantriklik sekmesini seçin ve ardından sekmesinde sütunlardan herhangi birini seçin. "Ayarlar" menüsünden "Varsayılan elips boyutu" seçin.
    2. Bir nesneyi seçin ve "gözden geçirin" butonuna tıklayın. Açılır menüden "Elips ayarlama".
    3. Elips ve sol üst noktasını temsil eden iki nokta belirir. Onları hem boyutlandırır ve iki yeni nokta açısından yeniden merkezleri elips taşıma.
    4. Bu noktaları kendi istediğiniz pozisyonları ayarlandıktan sonra, Enter tuşuna basın. Elips yeniden çizilecek. Pozisyonu kabul edilebilir değilse, tekrar Enter tuşuna basın ve sütun değerleri güncellenir.
    5. Iç elips yeniden şekillenen olmadan hareket gerekiyorsa, merkezi noktaları olan nesneler, tıklayın. İki satır ve üç yeşil noktalar belirir. Yeniden boyutlandırma olmadan elips taşımak için yeni bir konuma meyve merkezinde yaklaşık olarak konumlandırılmış noktasını taşımak.
    6. Bitirmek için Enter tuşuna basın.
  8. Pericarp sınır ayarlayın. Bu fonksiyon kullanıcı pericarp bölgeyi tanımlamak için izin verir ve pericarp alanı "ve" pericarp kalınlığı enlem bölümünde "sekmesinde" seçilen "ayarlanması gerekiyor.
    Not: aşırı olgun meyve, meyve kalan pericarp ayırt etmek zor ya da imkansız olabilir.
    1. Bir nesneyi seçin ve beni "gözden geçirin" menüsünü tıklayınnu. "Varsayılan pericarp sınır" seçin ve pericarp en uygun varsayılan ayarlamak.
    2. Daha fazla ayar için, "ayarlayın pericarp sınır" açılır menüsünü "gözden geçirin" açılır menüden seçin.
    3. Sağ üst pencere, değiştirilmesi gerekir pericarp sınır konumu seçin. Bu başlangıç ​​noktası ve bitiş noktası yanlış sınır tıklayarak sol tarafından gerçekleştirilir. Sonuç olarak, ayrılmış sınır silinecektir. En iyi sonuç için, mümkün olan en küçük sınır bölümünde herhangi bir zamanda seçili olmalıdır.
    4. Yeni bir sınır eklemek için ilk nokta, ikinci nokta geri sol tıklayın. Istenilen kontur takip tıklayarak devam edin. Sağ tıklayarak bir önceki değişiklik geri alınır. Çoklu değişiklikler ardışık sağ tıklama ile geri alınabilir.
      Not: Çok fazla pericarp sınır değişiklikler programın çökmesini neden olabilir.
    5. Yeni sınır onaylamak için "Enter" tuşuna basın. Aksi takdirde, bu işlemi iptal etmek için "Esc" tuşuna basın.
    6. Sınır orijinal konumuna geri dönmek için "Reset pericarp Sınır" seçin.
  9. Renk analizi için, meyve görüntünün kenarında etten sınır değildir (örneğin, Şekil 4'te gösterildiği gibi enine kesim üzerinde meyve cilt gösteren meyve omuz enine kesilmiş), kullanıcı "Ayarlar" menüsü altındaki "Renk Testi" iletişim kutusunu açmak gerekiyor. Bu iletişim kutusunda, en az mavi değeri 30 ayarlanır ve kaydedilir. Meyve <3 cm, 20 minimum mavi değeri ayarlayın. Bu değer, TA doğru sınırları bulmakta sorun varsa daha da ayarlanabilir gerekebilir.

6. Kullanıcı tanımlı ayarlar

Bazı özellikler için kullanıcı ölçüm alınması gereken ayarları seçmek için ihtiyacı vardır. Bu analizden önce veya sonra yapılabilir ve bir deney, daha önce veya kullanıcı yeni bir analiz için uygun ayarı tanımlamak için keşif analizleri yapmak isteyip istemediği gibi aynı ayarları tekrar edilip edilmeyeceğine bağlı olacaktır.

  1. Distal ve proksimal sonuna blokluluk ayarlanması. Blokluluk, orta genişliği (Şekil 5A) meyve / distal proksimal ucuna yakın yükseklikte bir kullanıcı tarafından seçilen oranda genişlik oranı olarak hesaplanır. Bu kullanıcı ölçüm alınır nesne konumu seçin ya da değiştirmeye izin verir. , "Ayarlar" butonuna altında "blokluluk pozisyonu" yeni bir değer girerek alt ve üst blokluluk pozisyonları değiştirilebilir.
  2. Mikro ve makro açılarının ayarlanması. Bu ayarlar meyve biter (Şekil 5B) çeşitli pozisyonlarda açıları hesaplamak için kullanılır. Makro ayarı genellikle sınır boyunca% 5 - 40 ve mikro ayar sınırı boyunca 2 ila 10% kullanılır açıları için kullanılır.
  3. Morfometrik noktalarının sayısı. Bu işlevi yüklenen görüntünün her nesnenin sınır boyunca noktaları bulur. Distal ve proksimal uçları dönüm noktaları olarak görüntüde her nesne için kullanılır. "Ayarlar" menüsü altındaki "# morfometrik noktaları" sınır boyunca ölçülen noktaların sayısı seçilebilir. 4 ile 30 arasında puan seçilebilir. Yazılım otomatik olarak yarıya seçilen noktaların sayısına bölün ve distal ve proksimal uçları arasında meyve her iki tarafta eşit dağıtacak.

7. Veri kaydetme ve dışa aktarma

  1. Verileri kaydetmek
    1. TA tarafından bir görüntü ve görüntü analizi manuel ayarlamalar sonra, "Kaydet Meyve" düğmesine tıklayın. Manuel ayarlar ve seçili nesneler dahil olmak üzere tüm güncel bilgileri, orijinal görüntü olarak aynı ad ve tmt uzantısı ile yeni bir dosya kaydedilecektir. Orijinal dosya ile bağlantılı, çünkü her zaman bir dosya seçilir, aynı adla kaydedilen tmt dosya otomatik olarak açılır olacaktır. Ancak, tmt dosyası jpg resim dosyası olarak (bkz. bölüm 4.1) aynı klasörde saklanmalıdır. Yazılım, aynı klasör içinde, tmt ve jpg dosyaları saklamak değilse, görüntü klasörünü C sürücüsüne taşıyın.
    2. Ayarlamalar olmadan, orijinal görüntü dosyası dönmek için, sadece ilgili tmt dosyasını silin. Alternatif bir "Analiz" ve orijinal görüntünün tekrar analiz seçmek için. Ancak, görüntü olarak aynı adı taşıyan herhangi bir tmt hala görüntü Tabii, ayarlamaları, tmt dosyanın üzerine kaydedilir, sürece dosya açıldığında bir dahaki sefere ile ilişkili olacağını unutmayın.
  2. Ihracat verileri
    1. Kullanıcı "Export" düğmesine seçerek bireysel bir görüntü için veri verebilirsiniz. Verileri bir Excel dosyası ihraç ve her bir meyve, ortalama ve standart sapma için özellik değerlerini görüntülemek olacaktır.
    2. TA uygulaması da ("Toplu Analizi" fonksiyonu) iki veya daha fazla görüntü öznitelik değerleri verebilirsiniz.
      1. Start toplu iş analizi kadar, "Open Image" düğmesine tıklayın.
      2. Toplu analiz edilecek görüntü dosyalarını seçin. Ek dosyaları seçerken "Shift" veya "Ctrl" tuşunu kullanarak birden fazla dosya seçilir. Dosyaları seçtikten sonra "Aç" tuşuna tıklayın.
      3. Kullanıcı toplu analiz çıktı türünü seçmek için istenecektir: "görüntü başına bireysel ölçümler", "Ortalama ve Standart Sapma", "Sadece ortalama" veya. Ihracat iki mod bir örnek Şekil 6'da gösterilmiştir.
      4. Oluşturulacak Excel dosyası için bir ad seçin ve "Kaydet" tuşuna tıklayın. Yazılım otomatik olarak dosyaları açmak ve toplu iş analizi başlayacaktır. Görüntü dosyaları daha önceden analiz ve TA tarafından kaydedilmiş varsa, kaydedilir. Tmt dosyaları toplu iş analizi için açılacak. Dosyaları daha önceden analiz edilmemiş varsa, yazılım, manuel ayarlar ve deselections olmadan görüntü analizi gerçekleştirmek. TA 600 dpi çözünürlükte en az 100 görüntülerin bir toplu iş analizi yapabilir.
      5. Renk Analizi için Toplu Analizi. Ayar menüsü altında "Renk Testi" seçeneğini açın. Toplu İş Analizi ve analiz tıklatın. Analiz etmek için görüntüleri seçmek için yeni bir pencere görünecektir. Bir sonraki pencerede veri dosyası için bir ad ve dizin belirtin. Kaydet'i tıklatın. Çıktı dosyası, her resmin adı (dosya adı dayalı) ve görüntü üzerinde her meyve için ortalama renk değerlerini içerir. Çıktı dahil parametreler şunlardır: parametre 1, 2 parametresi, R, G ve B değerleri, parlaklık, L *, a * ve b * değerleri yanı sıra, renk tonu ve renk değerleri. Renk test modülü kadar 100 meyve görüntüleri bilgisayar s donanım bağlı olarak bir toplu iş analizi yapabilirsiniz.

8. Veri analizi örnekleri

TA tarafından oluşturulan çıkış birçok uygulama için kullanılabilir. Genetik çalışmalar, çıkış, farklı yetiştirilen domates (S. Lycopersicum) çeşitleri ve yabani türlerin arasında haçlar türetilen çeşitli ayırma popülasyonlarda meyve şekli QTL (Kantitatif Sürekli Loci) tespit etmek için kullanılır S. pimpinellifolium üyelik LA1589 1,4,5. TA ayrıca şekil kategorilerinin 6 meyve domates meyve renk renk değişikliği, fizyolojik bir bozukluk "sarı omuz" 3 nedeniyle sınıflandırmak ve analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, yazılım, 7 ve tohum 8,9 yaprakları gibi diğer bitki organları analiz etmek için kullanılır olmuştur .

9 - Temsilcisi Sonuçlar

TA çıkış yaygın olarak çeşitli uygulamalar için kullanılır olmuştur. Meyve şekli QTL çalışmalarda her nüfus toplam 96 ila 130 bitkileri, meyve görüntüleri (tek bir görüntü, bitki başına 8 ila 10 meyve) toplandı. Daha sonra, bu görüntüleri TA 4,5 ile analiz edildi. Fenotipleri ve genotipleri arasındaki ilişkiyi saptamak için, kompozit aralığını kullanarak haritalama 10,11 QTL analizleri yapıldı ve her nüfusu 12 öznitelikleri altkümelerini multitrait kompozit aralığı haritalama. Sonuç olarak, pek çok bölgede, domates, genom kontrol meyve şekli tespit edildi. Diğerleri bir nüfusa özgü iken, bu bölgelerin bazıları, çeşitli popülasyonlarda mevcuttu. Bazı meyve şekli QTLs (oval, güneş ve fs8.1 gibi) önceki haritalama çalışmaları bilinen iken, diğer bazı lokusların yeni keşfedildi. Toplam olarak, 17 ila 36 QTLs meyve şekli niteliklerini kontrol 2,4 üç ayırma popülasyonları tespit edildi.

TA tarafından oluşturulan veriler de Temel Bileşenler Analizi (PCA) kullanılarak analiz edilmiştir. Bir çalışmada, on beş şekli niteliklerini PCA tabi tutuldu ve ilk üç temel bileşenleri (PC) daha sonra özellikleri olarak eşleştirilir. Veri PC QTLs 4 bileşeni katkıda bulunan nitelik QTLs ile çakışan olduğunu göstermektedir. Ayırma popülasyonu da türe ait tüm kafa şekli niteliklerini tespit QTL ile özdeşleşmiş QTL karşılaştırmak için kullanılmıştır. Yine, QTL tür arasında 2 Vakaların% 93 QTL kontrol meyve şekil ve boyut nitelikleri ile örtüşmektedir gösterilmiştir. Bu sonuçlar, meyve morfolojisi analiz TA tarafından üretilen verilerin geçerliliği ve tekrarlanabilirlik açıkça göstermektedir.

TA başka bir uygulama amacı, meyve şekli ölçümleri dayalı domates çeşitlerin tanımlamak için bir meyve şekli sınıflandırma sistemi oluşturulması. ~ 350 farklı köken ve meyve morfolojisi domates katılmalar germplazma toplama değerlendirildi. Her bitkinin meyve yaklaşık sekiz sayısallaştırılmış ve TA ile analiz edildi. İki mevcut sınıflandırma sistemleri, IPGRI 13 ve UPOV 14, değerlendirilir ve bizim toplama meyve görüntüleri görsel karşılaştırmalar kullanılarak karşılaştırıldı. Biz, çeşitli kategoriler birleştirerek ve iki yeni 6 oluşturarak, bu iki sistemin morfolojik sınıflandırma değiştirilebilir. Proposed kategori yassı, yuvarlak, uzun, dikdörtgen obovoid, elipsoid, kalp ve oxheart. IPGRI 13 ve UPOV 14 sistemler adapte sekiz yeni kategoride daha görsel olarak ayırt edilebilir ve TA ölçümleri kullanılarak test edildi. Her üyelik 37 öznitelikleri TA çıkış her meyve şekli kategorisinde en iyi tanımlamak ve aynı zamanda discriminator nitelikleri, her bir katılım görsel sınıflandırma açıklamak ne kadar doğru değerlendirmek için ölçümleri tanımlamak için PCA ve Doğrusal Diskriminant Analizi (LDA) maruz kaldı. Bu meyve şekli sınıflandırma sisteminin olası bir uygulama, fenotipik veri dayalı küme katılmalar TA çıkış kullanmak ve farklı meyve şekli kategorileri arasındaki ilişkileri belirlemek.

TA Renk Testi modülü S. arasında haçlar türetilmiş bir kendilenmiş backcross (IBC) nüfusu bir kolorimetre (CR300) ile çekilen renk ölçümleri ile karşılaştırılmıştır lycopersicum işleme çeşitlerin 3. L *, a * ve b * kolorimetre değerleri TA ile üç farklı tarayıcılardan elde edilen renk değerleri ile karşılaştırılabilir. Ancak, üç tarayıcılar arasındaki farklılıklar nedeniyle, donanım, yazılım, ya da standardize RGB değerleri gözlenmiştir. Sonuç olarak, düzeltme değerleri girmek için bir seçenek tarayıcı kalibrasyon izin Renk Testi uygulanmıştır. TA Renk Testi kullanılarak genetik bir çalışma, renk ve renk bütünlüğü için genetik varyans, bu değerleri kolorimetre elde edilmiştir göre anlamlı derecede yüksek idi. Bu farklılıklar, kolorimetre yüzeyinde sadece birkaç puan analiz ise tüm yüzey TA ölçüm renk parametrelerine bağlıdır. Son olarak, TA test edilmiş ve diğer bitkileri, patates, salatalık, kavun ve çilek 3 gibi renk ve renk tutarlılığı analiz edebilmek idi.

Şekil 1
Şekil 1. Standart renk ve farklı zamanlarda farklı tarayıcılardan elde edilen renk değerleri kalibre Renk Testi modülü için ekose desenli.

Şekil 2
Şekil 2. Yüksek kalitede dijitalleşmiş görüntüler TA düzgün işleyişi için gereklidir. A) düşük kaliteli görüntü bir örnek. TA, görüntü boyunca nesneleri bulmak için çalışacaktır. Burada gösterilen gibi büyük boş alanlar vardır, TA düzgün çalışması veya kilitlenme olmayabilir. Bazı meyveler, kuru lekelenen değildi ve tarayıcı ekranında suyu doğru meyve sınır tanıma TA önleyecektir. Ayrıca, meyvelerin çoğu yanlış dikey olarak yönlendirilmiş, pek çok niteliklerini doğru hesaplanır olmaz. Bu düşük kaliteli görüntüleri analiz öncesinde yapılması gereken kapsamlı manuel ayarlamalar nedeniyle önemli ölçüde meyve şekli analiz yavaşlatacaktır. B) yüksek kaliteli görüntü bir örnek. Meyve, birbirlerine dokunmadan ve kuru lekelenen olmasa da doğru dikey aralıklı yakın odaklı.

Şekil 3
Şekil 3 TA yazılımın ekran görüntüsü. Üst pencerenin birkaç mevcut araçları (yani, açık görüntü, meyve, ihracat verileri, uygun boyutu, analiz ve revize kaydetmek) için düğmeler gösterir. Sağ üst pencere nesne manuel ayarlamalar için seçilmiştir ve veri sağ alt pencerede görüntülenir. Bu meyve için değerleri sağ alt veri penceresinde gri renkte vurgulanır. Mavi belirtilen nesneler analizlere dahil edilmez ise sol pencerede sarı belirtilen nesneler analizleri dahil edilecektir.

Şekil 4
Şekil 4. Domates Analyzer - Renk Testi uygulaması için kullanılan bir görüntü.

Şekil 5
Şekil 5 Kullanıcı tanımlı ayarlar. A) blokluluk nitelikleri. Üst pozisyonda proksimal ucuna blokluluk ve üçgen özellikleri hesaplamak için kullanılır. X (= bu rakam% 10) ölçülür Üst pozisyon için ayar belirler. Alt konumda, distal ucu blokluluk ve üçgen özellikleri hesaplamak için kullanılır. Y (= bu rakam% 90) ölçülür Alt pozisyon için ayar belirler. Bu pozisyonlar için değerleri, meyve üst yükseklik yüzdesi eşittir. B) Makro açısı nitelikleri. Yeşil çizgiler açısı ölçüldü olacak sonunda (resimde siyah kare) sınır boyunca yüzdesi (=% 20 rakamı) temsil eder. Yazılım + / kullanarak eğim belirleyecek seçilen değeri% 5. Seçilen değeri% 2 - mikro açılar için yazılım + / kullanarak eğim belirleyecektir.

Şekil 6
Şekil 6. İhracat aracı ile elde edilen görüntü çıkış verileri bir örnek Şekil 3'te gösterdi. A) Çıkış her meyve, ortalama ve standart sapma öznitelik değerleri görüntüleme. B) Çıkış ortalama 10 domates çeşitleri için öznitelik değerleri ve standart sapma gösteren.

  L * * b *
1 37,986 13,555 14,059
2 65,711 18,13 17,81
3 49,927 -4,88 -21,925
4 43,139 -13,095 21,905
5 55,112 8,844 -25,399
6 70,719 -33,397 -0,199
7 62,661 36,067 57,096
8 40,02 10,41 -45,964
9 51,124 48,239 16,248
10 30,325 22,976 -21,587
11 72,532 -23,709 57,255
12 71,941 19,363 67,857
13 28,778 14,179 -50,297
14 55,261 -38,342 31,37
15 42,101 53,378 28,19
16 81,733 4,039 79,819
17 51,935 49,986 -14,574
18 51,038 -28,631 -28,638
19 96,539 -0,425 1,186
20 81,257 -0,638 -0,335
21 66,766 -0,734 -0,504
22 50,867 -0,153 -0,27
23 35,656 -0,421 -1,231
24 20,461 -0,079 -0,973

Tablo 1: L *, a *, b * renk denetleyicisi her yama için değerleri (bkz. Şekil 1). Aydınlatıcı kaynağı D50 ve gözlemci açısı 2 ° idi.

Discussion

Bitki organ morfolojisi ve renk Yüksek verimlilik ve doğru değerlendirme, çünkü kantitatif doğa ve sık sık öznel kantifikasyon zordur. TA, yüksek verimlilik ve yarı-otomatik bir şekilde çeşitli meyve morfolojik ve kolorimetrik özelliklerinin objektif ve doğru ölçümler sağlar. TA yararlılığını 2,4,5 QTL domates meyve şeklinin belirlenmesi için başlatılan çalışmalar ile kanıtlanmıştır. Buna ek olarak, cultivars6 sınıflandırma ve türlerin bir grup taksonomi TA 15,16 çıkış kullanılarak değerlendirilmiştir. Domates meyve şekli uzatılmış meyve 17 gen SUN sonuçları Yüksek ifadesi. TA, yaprak ve kotiledon şeklini kullanarak, uygulamanın yanı sıra diğer bitki organlarının morfolojisi ölçmek için etkin bir şekilde kullanılabilir olduğunu gösteren, yüksek bir seviye 7 SUN ifade hatları belirlendi . Ayrıca, TA, domates ve ayçiçeği 8,9 tohum büyüklüğü genetik temeli belirlenmesinde son derece önemli olmuştur . Son olarak, TA uygulanan Renk Testi modülü domates meyve rengini analiz etmek için diğer yöntemlere göre daha hassas ve daha doğru, daha ucuz ve daha. Özet olarak, TA, objektif ve güvenilir bir değerlendirme bitki organlarının morfolojisi ve renk çeşitliliği için önemli bir araç haline gelmiştir.

Acknowledgments

Bu araştırma, Ulusal Bilim Vakfı (DBI 0.227.541) tarafından desteklenen oldu.

References

  1. Brewer, M. T. Development of a controlled vocabulary and software application to analyze fruit shape variation in tomato and other plant species. Plant Physiol. 141 (1), 15-25 (2006).
  2. Gonzalo, M. J. Tomato Fruit Shape Analysis Using Morphometric and Morphology Attributes Implemented in Tomato Analyzer Software Program. Journal of the American Society for Horticultural Science. 134 (1), 77-87 (2009).
  3. Darrigues, A. Tomato analyzer-color test: A new tool for efficient digital phenotyping. Journal of the American Society for Horticultural Science. 133 (4), 579-586 (2008).
  4. Brewer, M. T., Moyseenko, J. B., Monforte, A. J., van der Knaap, E. Morphological variation in tomato: a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development. J Exp Bot. 58 (6), 1339-1349 (2007).
  5. Gonzalo, M. J., Knaap, E. vander A comparative analysis into the genetic bases of morphology in tomato varieties exhibiting elongated fruit shape. Theor Appl Genet. 116 (5), 647-656 (2008).
  6. Rodríguez, G. R. Diversity of SUN, OVATE and FAS in the tomato germplasm and their effect on fruit morphology (in preparation. , Forth Coming Forthcoming.
  7. Wu, S. Masters Thesis. , The Ohio State University. (2009).
  8. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genet. 5 (1), e1000347-e1000347 (2009).
  9. Yue, B., Cai, X., Yuan, W., Vick, B., Hu, J. Mapping quantitative trait loci (QTL) controlling seed morphology and disk diameter in sunflower (Helianthus annuus L). Helia. 32, 17-35 (2009).
  10. Zeng, Z. B. Theoretical Basis for Separation of Multiple Linked Gene Effects in Mapping Quantitative Trait Loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (23), 10972-10976 (1993).
  11. Zeng, Z. B. Precision Mapping of Quantitative Trait Loci. Genetics. 136 (4), 1457-1468 (1994).
  12. Jiang, C. J., Zeng, Z. B. Multiple-Trait Analysis of Genetic-Mapping for Quantitative Trait Loci. Genetics. 140 (3), 1111-1127 (1995).
  13. International Plant Genetic Resources Institute. IPGRI Descriptors for Tomato (Lycopersicon spp.). , Roma, Italy. 47-47 (1996).
  14. International Union for the Protection of New Varieties of Plants. UPOV Guidelines for the Conduct of Tests for Distinctness, Uniformity, and Stability. TOMATO (Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten Ex Farw.). , Geneva. 51-51 (2001).
  15. Depypere, L., Chaerle, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P. Stony endocarp dimension and shape variation in Prunus section Prunus. Annals of Botany. 100 (7), 1585-1597 (2007).
  16. Depypere, L., Chaerle, P., Breyne, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P., P, A combined morphometric and AFLP based diversity study challenges the taxonomy of the European members of the complex Prunus L. section Prunus. Plant systematics and evolution. 279 (1-4), 219-231 (2009).
  17. Xiao, H., Jiang, N., Schaffner, E., Stockinger, E. J., van der Knaap, E. A retrotransposon-mediated gene duplication underlies morphological variation of tomato fruit. Science. 319 (5869), 1527-1530 (2008).

Tags

Bitki Biyolojisi Sayı 37 morfoloji renk görüntü işleme kantitatif trait lokusların yazılım
Domates Analyzer: İki boyutlu Objects Doğru ve detaylı Morfolojik ve Kolorimetrik Veri Toplama Faydalı Yazılım Uygulaması
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Rodríguez, G. R., Moyseenko, J. More

Rodríguez, G. R., Moyseenko, J. B., Robbins, M. D., Huarachi Morejón, N., Francis, D. M., van der Knaap, E. Tomato Analyzer: A Useful Software Application to Collect Accurate and Detailed Morphological and Colorimetric Data from Two-dimensional Objects. J. Vis. Exp. (37), e1856, doi:10.3791/1856 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter