Summary
Tomaat Analyzer (TA) kwantificeert eigenschappen van tweedimensionale vormen en kleuren op een reproduceerbare en nauwkeurige wijze. Een stap-voor-stap procedure voor het verkrijgen van hoge kwaliteit gedigitaliseerde beelden van tomaten, morfologische en kleur analyse van deze beelden en diverse applicaties met behulp van de gegevens die zijn gegenereerd door middel van deze software worden beschreven.
Abstract
Het meten van fruit morfologie en de kleur eigenschappen van groente en fruit gewassen in een objectieve en reproduceerbare manier is van belang voor een gedetailleerde fenotypische analyse van deze eigenschappen. Tomaat Analyzer (TA) is een software programma dat 37 attributen met betrekking tot twee-dimensionale vorm in een semi-automatische en reproduceerbare wijze 1,2 maatregelen. Veel van deze kenmerken, zoals hoeken bij de distale en proximale uiteinden van de vrucht en gebieden van inspringen, zijn moeilijk te kwantificeren handmatig. De attributen zijn onderverdeeld in tien categorieën in de software: Basis meting, Fruit Shape Index, blokvorming, Homogeniteit, proximale Fruit eindvorm, Distale Fruit eindvorm, asymmetrie, interne Excentriciteit, breedte-sectie en Morfometrie. De laatste categorie vereist geen voorkennis, noch vooraf bepaalde noties van de vormkenmerken, zodat morfometrische analyse biedt een onpartijdige optie die beter kan zijn high-throughput analyses aangepast dan attribuut analyse. TA biedt ook de Color Test applicatie die is ontworpen om kleur metingen te verzamelen van gescande afbeeldingen en scanapparaten worden gekalibreerd met behulp van kleurnormen 3 mogelijk te maken.
TA biedt verschillende opties om te exporteren en te analyseren vorm attribuut, morfometrische, en kleurgegevens. De gegevens kunnen worden geëxporteerd naar een Excel-bestand in de batch-modus (meer dan 100 afbeeldingen in een keer) of geëxporteerd als afzonderlijke beelden. De gebruiker kan kiezen tussen de output dat de gemiddelde weergeeft voor elk attribuut voor de objecten in elk beeld (inclusief de standaarddeviatie), of een output die de attribuutwaarden displays voor elk object op de afbeelding. TA is een waardevol en doeltreffend instrument voor identificeren van en bevestigen tomaten vorm Quantitative Trait Loci (QTL), evenals het uitvoeren van diepgaande analyses van het effect van belangrijke vruchtvorm genen op planten morfologie. Ook kunnen TA gebruikt worden om objectief fruit in te delen in verschillende vorm categorieën. Ten slotte kan fruit vorm en kleur eigenschappen in andere plantensoorten, alsmede andere plantaardige organen zoals bladeren en zaden worden geëvalueerd met TA.
Protocol
Tomaat Analyzer (TA) software is ontworpen om objecten van een bepaalde grootte en resolutie, gemeten in punten (pixels) per inch (dpi) te erkennen. De software bepaalt automatisch de grenzen van fruit in een gescande afbeelding. Het object grens is bepaald door contour tracing, wat resulteert in een lijst van aangrenzende punten beschrijven van de rand van een object in een beeld. Al het fruit vorm metingen zijn berekend op basis van de grenzen. De kleur-test module "Tomaat Analyzer Color Test" is ontworpen om de kleur parameters binnen de grenzen herkend door de software te kwantificeren. De kleur metingen zijn gebaseerd op de RGB-kleurruimte: R (rood), G (groen) en B (blauw). De gemiddelde RGB-waarden voor elke pixel wordt genomen door Color-test module en vervolgens vertaald naar de CIELAB kleurruimte die gebruik maakt van L *, a *, b * om kleur te beschrijven op een manier die de menselijke visuele waarneming benadert. De Color-test module berekent Hue en Chroma kleur descriptoren op basis van een * en b *.
Een stap-voor-stap protocol is beschreven voor digitalisering van tomaten en de daarop volgende semi-automatische analyse van de morfologie en de kleur attributen met behulp van de TA-software pakket. Het protocol is verdeeld in acht stappen: 1) Selectie en voorbereiding van plantmateriaal, 2) Image collectie, 3) Software-installatie, 4) Beeldanalyse en kalibratie voor de TA Color Test, 5) Handmatige aanpassing van de attributen, 6) User- gedefinieerde instellingen, 7) opslaan en exporteren van gegevens, en 8) Voorbeelden van data-analyse.
1. Selectie en voorbereiding van plantmateriaal
- Fruit moet schoon en droog zijn.
- Vlezig fruit mag niet worden overrijpe omdat ontharden kan de vorm vervorming veroorzaken bij het snijden van het fruit.
- Snijd de vrucht met een scherp gekarteld mes of een nieuw scheermesje. Afhankelijk van het type van analyse en de attributen worden beoordeeld, moet fruit lengterichting of dwars gesneden worden door het centrum. Kleuranalyse kan worden toegepast op lengterichting of dwarsrichting gesneden fruit en andere secties ontwikkeld om specifieke kenmerken te markeren.
- Droog de interne deel van de vrucht door te deppen met een tissue of papieren handdoeken als de vrucht is zeer sappig.
2. Foto collectie
- Gesneden fruit en plaats op de scanner met de gesneden kant naar beneden. Plaats een liniaal boven en een label onder de vrucht. De liniaal wordt gebruikt om te controleren of de juiste scanresolutie is geselecteerd, en is belangrijk voor het nauwkeurig meten van fruit attributen. Voor de high-throughput analyse van de gegevens, is het van belang om fruit scannen vanaf slechts een plant (of genotype) op een tijd en op fruit dat is ofwel lengterichting of dwars doorgesneden, maar niet een combinatie van beide op dezelfde scan scan. Plaats vruchten dicht bij elkaar, maar voorkomen dat aangrenzende fruit aan te raken. Vermijd ook grote lege ruimtes tussen de vruchten op de scanner. Als de voorwerpen zijn te ver uit elkaar, moet de afbeelding worden gemanipuleerd met behulp van beeldbewerkingssoftware zoals Adobe Photoshop of GIMP voorafgaand aan de analyse met TA.
- Omdat TA software gebruikt beeldresolutie nauwkeurig te meten grootte, de juiste keuze van de scanresolutie is van belang voor latere analyse.
- In de regel, als de objecten zijn tussen 1 en 8 cm, scannen op 200 of 300 dpi (pixels / inch). Als de objecten zijn> 8 cm, scannen op 100 dpi. Voor zeer kleine (<1 cm) objecten zoals zaden, scannen op 750 dpi of hoger. Wanneer batch-analyse is gepland (zie hieronder) en de vrucht grootte is niet zeer variabel tussen de verschillende planten, is het handig om te kiezen een scanner resolutie-instelling voor alle afbeeldingen moeten worden verzameld voor hetzelfde experiment.
- Voor de kleur te testen, stelt u de resolutie van de scanner op 200 dpi als de vruchten <8 cm. Als de vruchten zijn> 8 cm, scannen op 100 dpi. Ook de output beeldformaat op het hoogste aantal van kleur beschikbaar zijn in de scanner.
- Voorwerpen moeten worden gescand met een zwarte of zeer donkere achtergrond te schaduwen die interfereren met de analyse te voorkomen. Een donkere achtergrond kan worden verkregen door het plaatsen van een kartonnen doos over de scanner, zodat al het licht is beperkt van het scherm. Als een witte achtergrond wordt gebruikt, zal TA niet functioneren, omdat de applicatie is geoptimaliseerd voor het gebruik van een donkere achtergrond.
- De afbeelding moet worden bijgesneden na de eerste scan (voor het opslaan van de afbeelding) om grote lege ruimtes te vermijden. Als het beeld niet bijgesneden in dit stadium moet worden bijgesneden met behulp van beeldbewerkingssoftware zoals Adobe Photoshop of GIMP voorafgaand aan de analyse met TA.
- Voor Color analyses, zal de scanner moeten worden gekalibreerd als de gebruiker van plan is om RGB-waarden te vertalen naar de universele L *, a * en b * schaal. Het scannen van de Color Checker (figuur 1) moet gebeuren vóór of tijdens het scannen van de vruchten. De gescande Color Checker moet worden opgeslagen in dezelfde map als de vrucht beelden. Scanner calibratie is nodig omdat scanners verschillen in hoe ze te vangen kleur data en de lichtbron kan veranderen na verloop van tijd bij herhaald gebruik.
- Het verkrijgen van kleur normen en scannen. Color normen moeten worden gekozen op basis van het brede scala aan kleuren die in het gewas van belang. Voor dit voorbeeld hebben we gekozen voor een standaard 24-kleurweergave chart (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, figuur 1). Scan de Color Checker als je zou scant de vruchten. Scanner kalibreren is toegelicht in paragraaf 4.7.
- Sla de gescande afbeelding als JPEG-bestand.
Opmerking: Wees voorzichtig en precies bij het plaatsen van de objecten op de scanner tijdens de foto collectie stap. Hoe beter de objecten zijn afgestemd, hoe minder handmatige aanpassingen nodig zijn bij het analyseren van het fruit in TA. Voorbeelden van lage en hoge kwaliteit afbeeldingen worden weergegeven in figuur 2.
3. Software-installatie
- Tomaat Analyzer (TA) versie 2.2.0.0 kan worden gedownload van http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm . De Tomaat Analyzer gebruikershandleiding en de tomaat Analyzer Color Test Manual zijn ook beschikbaar via deze website.
- TA is een Windows-besturingssysteem (versie 2000 of hoger).
4. Beeldanalyse en kalibratie voor de TA Color Test
- De map met beelden moet geplaatst worden op de harde schijf en niet in de "Mijn documenten" map of op een externe server. Anders zal TA niet redden de aangepaste afbeeldingen in dezelfde map als de originele beelden. Zorg ervoor dat de aangepaste foto's met de extensie. TMT zich in dezelfde map als het origineel. Jpg afbeeldingen (zie stap 6.1.1).
- Start het TA-programma zoals u elke andere software-applicatie door te dubbelklikken op het pictogram.
- De gebruiker moet u de dpi en meeteenheden om de juiste instellingen door te kiezen voor "Scanner DPI" uit het "Settings" menu. De dpi-instelling moet zodanig worden hetzelfde zijn als het beeldbestand dat de grootte van de metingen (hoogte, breedte, omtrek, oppervlakte) nauwkeurig zijn. De "gebruikt Units" in het dialoogvenster bepaalt de eenheden (cm, mm, in, of pixel) voor de data-uitgang. In hetzelfde dialoogvenster, kan de helderheid moeten worden aangepast wanneer de objecten zijn relatief donker.
Opmerking: De DPI en de units kunnen ook worden aangepast na het maken van handmatige aanpassingen of na beeldanalyse. - De gebruiker kan kiezen de attributen te meten door het selecteren van "Measurement Saved" van het "Instellingen" menu. Dit kan gedaan worden op elk moment tijdens of na de analyse. De attributen zijn gegroepeerd in tien categorieën (dat wil zeggen Basic Measurement, Fruit Shape Index, blokvorming, homogeniteit, proximale Fruit eindvorm, Distale Fruit eindvorm, asymmetrie, interne Excentriciteit, breedte-sectie en Morfometrie). Individuele kenmerken of een hele meting groep kan worden geselecteerd of gedeselecteerd door te klikken op de groep of attribuut. Alle attributen van een meting groep kan worden aangetoond door te klikken op de "+". De geselecteerde attributen worden weergegeven per categorie in het venster in de rechter benedenhoek van het scherm zoals weergegeven in figuur 3.
- Om te beginnen, klikt u op de "Open image" knop en selecteer het afbeeldingsbestand in het pop-up dialoogvenster. De geselecteerde afbeelding wordt getoond in het linker venster.
- Het analyseren van de geopende afbeelding, klik op de "Analyze" knop. Wanneer u klaar bent, wordt de omtrek van elke vrucht worden gemarkeerd met een gele lijn en de data worden weergegeven in de rechterbenedenhoek data venster. De software zal automatisch deselecteren zeer grote of kleine voorwerpen, zoals een heerser of label. De objecten worden geselecteerd gemarkeerd met een blauwe lijn. Extra vruchten kunnen worden uitgeschakeld door rechts te klikken op hun imago. Alleen items die in geel worden weergegeven in het data-scherm en geëxporteerd (figuur 3). Items die in blauw wordt niet opgenomen in de analyses. Individuele objecten worden weergegeven in het bovenste venster rechts door met de linkermuisknop op te klikken met de muis.
Opmerking: De gegevens van de Color-test module worden niet weergegeven in het onderste juiste gegevens venster. - Analyseer de Color Checker voor Color analyse.
- Color Checker en het verzamelen van L *, a *, b * waarden. Open de gescande afbeelding Color Checker en analyseren zoals beschreven voor fruit. Zorg ervoor dat TA herkent elke patch als een object om te analyseren (gele grens). Als u gebruik maakt van een standaard Color Checker, kan de software niet in staat zijn om de donkere zwaden te herkennen. Deze kleuren worden niet opgenomen in de kalibratie. Onder het menu Instellingen, selecteer "Color Test". Het dialoogvenster verschijnt. Zorg ervoor dat de correctie waarden zijn ingesteld op een voor de helling (links dozen) en 0 voor de y-as (rechts dozen). Minimum blauw waarde moet worden ingesteld op 0, en de parameters 1 en 2 kan worden genegeerd. Klik op de knop Analyseren in de kleur te testen dialoogvenster. Een nieuw venster zal verschijnen om te redden ee-uitgang als een "CSV" document dat kan worden geopend in Excel. Geef de naam en de directory voor het gegevensbestand. De output data bestand bevat de RGB-waarden, L *, a *, b * waarden en berekeningen voor tint en chroma voor elke kleur patch.
- Het bepalen van de correctie waarden voor kalibratie. Plot de L *, a *, b * waarden voor elke kleur patch tegen colorimeter waarden voor L *, a * en b * die beschikbaar zijn van de fabrikant van de Color Checker of in tabel 1. Bepaal de regressievergelijking en noteer de helling en de y-as voor elke parameter. In het dialoogvenster, voer het omgekeerde van de helling en de achterkant van het teken van de y-as de waarde voor L *, a * en b *. Deze waarden worden gebruikt als correctie waarden voor de "Color Test"-instellingen.
- Kleur-test kan de gebruiker te definiëren twee parameters die het aandeel (%) van de pixels die vallen in bepaalde reeksen van de gekozen tint waarden rapport. Voor de analyse van tomaat, bijvoorbeeld de onderste en bovenste waarden voor parameter 1 zijn 70 en 100, respectievelijk, die overeenkomen met ongewenste geel en groen-gele vleeskleur. De onderste en bovenste waarden voor parameter 2 zijn 0 en 50 en komen overeen met de gewenste rode kleur. Sla de instellingen op voor deze waarden. Deze waarden worden toegepast op alle beelden die worden geanalyseerd totdat het programma wordt gesloten. Voor gescande afbeeldingen, selecteert u de "lichtbron C 2 °" optie. De "Illuminant D65 10 °" optie is alleen van toepassing voor de beelden die in natuurlijk licht.
- Resultaten visualisatie (zie figuur 3): Elke rij van gegevens in de lagere juiste gegevens window correspondeert met een bepaald object in het beeld. De gegevens worden weergegeven in dezelfde volgorde als de objecten in de afbeelding. De eerste regel toont de waarden voor het object in de linkerbovenhoek en de laatste data regel toont de waarden voor het object in de rechter benedenhoek van het beeld. Klik op een rij om de overeenkomstige fruit in het bovenste venster aan de rechterkant weer te geven. U kunt ook op een fruit en de bijbehorende data rij wordt gemarkeerd. Door te klikken op het attribuut tab in de lagere rechter venster is het mogelijk om te zien hoe het attribuut wordt gemeten voor elk afzonderlijk fruit. Bijvoorbeeld door te klikken op het distale uiteinde hoek, wordt de hoek gemeten door de software op de vruchten in het linker venster worden getoond. Deze functie is erg handig bij het identificeren van objecten die handmatige correctie voor meer accurate meting vereisen.
Figuur 4 toont een afbeelding om te analyseren met Color-test module. Echter, de resultaten niet te zien in het data-scherm. De gegevens zijn alleen toegankelijk in een Excel-bestand nadat de analyse is opgeslagen.
5. Handmatige aanpassing van de attributen
Soms is de grens van het fruit en de proximale en distale uiteinden zijn niet goed gevonden door TA. Ook als fruit worden geplaatst onder een hoek op de scanner, moet het beeld worden aangepast aan de juiste afmetingen te verkrijgen. Deze en andere functies kunnen worden gecorrigeerd door middel van handmatige instelling van de beelden na de eerste analyse. De beschikbare instellingen verschijnen onder de "herzien" menu-knop en omvatten: Roteren, Boundary, proximale uiteinde, distale uiteinde, Auto-roteren, Aanpassen Ellipse, Pas Distale uitsteeksel, Pas Pericarp Boundary, Standaard Pericarp Boundary.
Opmerking: Als de afstellingen moeten worden gemaakt, past u eerst de grens, gevolgd door de rotatie. Alle andere aanpassingen kunnen gemaakt worden in willekeurige volgorde na deze twee instellingen. Een aanpassing geselecteerd in het kader van de Revise menu blijft geselecteerd tot een andere aanpassing is gekozen. Hierdoor kan de gebruiker uit te voeren op dezelfde aanpassing op een opeenvolging van schijfjes door te klikken op de afbeelding en plak op de knop herzien. Hieronder zijn handmatige aanpassingen op verschillende fruit attributen gedetailleerd.
- Grens
- Klik met de linkermuisknop op het fruit in het linker venster. Het zal verschijnen in de rechterbovenhoek venster.
- Klik op de pijl naast het "herzien" knop en selecteer "Boundary" uit het drop down lijst in het venster rechts boven. Selecteer de grens locatie gewijzigd worden door links te klikken op de start-en eindpunt van de onjuiste grens. Als een gevolg hiervan zal het afgebakende grens worden verwijderd.
- Het toevoegen van een nieuwe grens, links klikken op het beginpunt naar het eindpunt. Ga door met klikken op de gewenste contour te volgen. Rechts te klikken zal ongedaan een eerdere wijziging. Meerdere wijzigingen kunnen ongedaan worden gemaakt door opeenvolgende rechts klikken.
- Ter bevestiging van de nieuwe grens, druk op de "Enter" toets. Anders, druk op de "Esc" toets om deze bewerking te annuleren.
- Klik op "Reset Boundary" om terug te keren naar de oorspronkelijke grens instelling.
- Draaien. Deze functie wordt gebruikt wanneer een object is niet volledig verticaal.
- Klik op de juiste fruit in het linker venster. Het zal verschijnen in het venster rechts boven.
- Klik op de pijl naast het "herzien" knop en selecteer "Roteren"uit de keuzelijst.
- Een as worden weergegeven in het venster rechts boven. Sleep de groene plein aan het einde van de as en de vrucht zal dienovereenkomstig draaien.
- Dubbel klik in het venster of druk op de "Enter" toets om te voltooien.
- Klik op "Reset Rotation" om terug te keren naar de oorspronkelijke uitlijning.
- Pas proximale uiteinde. Als er een fout in de positie van het proximale uiteinde, zullen de metingen afgeleid van deze functie onjuist zijn. Selecteer een vrucht die aanpassingen vereist, zodat het lijkt in het venster aan de rechterkant. Selecteer vervolgens de "Proximale vrucht eindvorm" tab en de 'proximale hoek van micro-of macro "in de data-uitgang gedeelte onder de geselecteerde fruit. De proximale hoeken wordt nu weergegeven voor elke vrucht in de afbeelding aan de linkerkant. Op deze manier kunnen hoeken die lijken ongewoon worden geïdentificeerd. Om de positie van het proximale uiteinde, als volgt te werk:
- Klik op de gewenste vruchten in het linker venster. Het zal verschijnen in de rechterbovenhoek venster.
- Klik op de pijl naast het "herzien" knop en selecteer "proximale uiteinde" uit het drop down lijst.
- In het venster rechts boven, klik en sleep de vertex-indicator in de juiste positie.
- Dubbelklik op of druk op de "Enter" om te voltooien.
- Pas distale einde. De positie van het distale uiteinde van het object kan ook handmatig worden gewijzigd. Om efficiënt te vinden fruit dat distale einde aanpassingen nodig, volgt u dezelfde procedure als voor het proximale uiteinde.
- Klik op de gewenste vruchten in het linker venster. Het zal verschijnen in de rechterbovenhoek.
Klik op de pijl naast het "herzien" knop en selecteer "distale uiteinde" uit het drop down lijst. - In het venster rechts boven, klik en sleep de vertex-indicator in de juiste positie.
- Dubbelklik op of druk op de "Enter" om te voltooien.
- Klik op de gewenste vruchten in het linker venster. Het zal verschijnen in de rechterbovenhoek.
- Distale uiteinde uitsteken. Met deze functie kan de gebruiker de eindpunten te definiëren op de grens van de tip.
- Onder de "distale Fruit eindvorm" tab, selecteer de kolom "distale uiteinde uitsteken" en selecteert u het object aan te passen.
- Klik op de pijl naast het "herzien" knop en selecteer "Pas Distale uitsteken" uit het drop down menu.
- Sleep de punten die verschijnen om de gewenste posities langs de grens.
- Druk op de Enter-toets om te voltooien. Een lijn verschijnt met de cutoff van de tip gebied en herberekent de tip gebied. De resultaten verschijnen in het distale uiteinde uitsteeksel kolom. Als de tip gebied is niet in de gewenste positie, zal het selecteren van "Reset Distale uitsteken" onder het "herzien" knop reset de punten naar hun oorspronkelijke posities. Als een tip gebied is gevonden, maar zou niet moeten bestaan, zal het selecteren van "Elimineer Distale uitstulping" van het "herzien" knop gaan de punten naar de onderkant van de vrucht, wat resulteert in een waarde van 0,0 voor de "distale uiteinde uitsteken" kolom.
- Automatisch draaien. Deze functie is speciaal ontwikkeld voor tomatenzaad, zodat ze automatisch kunnen worden uitgelijnd met de punt in dezelfde richting. Op dit moment werkt auto-rotate functie niet werkt op andere objecten, zoals fruit.
- Aan te passen ellips. Met deze functie kan de gebruiker om het formaat en / of de interne ellips te verplaatsen naar interne fruit gebieden te definiëren. Deze eigenschap wordt gebruikt voor de interne Excentriciteit functie en Fruit Shape Index Interne attribuut van TA.
- Selecteer de interne Excentriciteit tabblad en selecteer vervolgens een van de kolommen in het tabblad. Selecteer een "standaard ellips grootte" van het "Settings" menu.
- Selecteer een object en klik op de "herzien" knop. Selecteer "Adjust Ellipse" uit het drop down menu.
- Twee punten zal verschijnen die de boven-en linkerkant punten van de ellips. Verplaatsen ze allebei past de grootte en re-centra van de ellips met betrekking tot de twee nieuwe punten.
- Zodra deze punten zijn ingesteld op de gewenste posities, druk op de Enter-toets. De ellips wordt opnieuw getekend. Als de positie acceptabel is, drukt u op Enter weer en de waarden in de kolommen wordt bijgewerkt.
- Als de interne ellips moet worden verplaatst zonder dat nieuwe vorm, klikt u op het midden van de objecten, waar de punten waren. Twee lijnen en drie groene punten zal verschijnen. Verplaats het punt ongeveer in het midden van de vrucht naar een nieuwe locatie om de ellips te verplaatsen, zonder het schalen.
- Druk op Enter om af te maken.
- Pas pericarp grens. Met deze functie kan de gebruiker bepalen het zilvervlies regio en moet worden aangepast, wanneer Pericarp gebied "en" Pericarp dikte "zijn geselecteerd in de" breedte-sectie "tabblad.
Let op: voor de vruchten die zijn over-rijp zijn, kan het moeilijk of onmogelijk om de vruchtwand te onderscheiden van de rest van het fruit.- Selecteer een object en klik op de "herzien" drop down menu. Selecteer "Default pericarp grens" en stel de standaard die het beste past bij de zilvervlies worden veroorzaakt.
- Voor verdere aanpassingen, selecteert u 'Adjust pericarp grens "van het" herzien "drop down menu.
- In de rechterbovenhoek venster, selecteer het zilvervlies grens locatie die moet worden gewijzigd. Dit wordt bereikt door links te klikken op de start-en eindpunt van de onjuiste grens. Als een gevolg hiervan zal het afgebakende grens worden verwijderd. Voor het beste resultaat moet de kleinst mogelijke deel van grens worden geselecteerd op een bepaald moment.
- Het toevoegen van een nieuwe grens, links klikken op het tweede punt terug naar het eerste punt. Ga door met klikken op de gewenste contour te volgen. Rechts te klikken zal ongedaan een eerdere wijziging. Meerdere wijzigingen kunnen ongedaan worden gemaakt door opeenvolgende rechts klikken.
Let op: Te veel pericarp grens aanpassingen kunnen het gevolg in crashen van het programma. - Ter bevestiging van nieuwe grens, druk op de "Enter" toets. Anders, druk op de "Esc" toets om deze bewerking te annuleren.
- Selecteer "Reset Pericarp Boundary" aan de grens terug te keren naar de oorspronkelijke positie.
- Voor de kleuranalyse, wanneer de grens van het vlees niet aan de rand van de vrucht afbeelding (bijvoorbeeld een dwarse snede op de Fruit schouder, met de huid van de vrucht boven de dwarse snede zoals weergegeven in figuur 4), de gebruiker moet de "Color Test" dialoogvenster te openen onder de "Settings" menu. In dit dialoogvenster, de minimale blauwe waarde moet worden ingesteld op 30 en opgeslagen. Als de vruchten zijn <3 cm, de minimale blauwe waarde tot 20. Deze waarde kan nodig verder worden aangepast indien TA heeft problemen met het vinden van de juiste grenzen.
6. Door de gebruiker gedefinieerde instellingen
Voor sommige attributen, moet de gebruiker het selecteren van de instellingen waarbij de meting moeten worden genomen. Dit kan gedaan worden voor of na de analyse en zal afhangen of een experiment te worden herhaald op dezelfde instellingen als voorheen werden gebruikt of dat de gebruiker wil verkennende analyses doen om de juiste instelling voor de nieuwe analyse te definiëren.
- Instellen van distale en proximale uiteinde blockiness. Blokvorming wordt berekend als de verhouding van de breedte bij een door de gebruiker geselecteerde deel van de hoogte van het dichtst bij het distale / proximale uiteinde van de vrucht aan het midden van de breedte (Figuur 5A). Hierdoor kan de gebruiker te selecteren of te wijzigen de locatie op het object waar de meting wordt genomen. De bovenste en onderste blokvorming posities kunnen worden gewijzigd door het invoeren van een nieuwe waarde in het "blokvorming positie" onder de knop "Setting".
- Instellen van micro-en macro-hoeken. Deze instellingen worden gebruikt voor het berekenen van hoeken op verschillende posities uit de uiteinden van de vrucht (Figuur 5B). De macro-instelling wordt meestal gebruikt voor hoeken 5 tot 40% langs de grens en de micro-instelling wordt gebruikt voor 2 tot 10% langs de grens.
- Aantal morfometrische punten. Deze functie vindt punten langs de grens van elk object in de geladen afbeelding. De distale en proximale einden worden gebruikt als herkenningspunt punten voor elk object in het beeld. Het aantal punten gemeten langs de grens kan worden geselecteerd door "# van morfometrische punten" in het "Settings" menu. Tussen de 4 en 30 punten kunnen worden geselecteerd. De software zal automatisch verdelen van het aantal punten geselecteerd in half en gelijkmatig te verspreiden aan elke kant van het fruit tussen de distale en proximale einden.
7. Opslaan en exporteren van data
- Gegevens opslaan
- Na handmatige aanpassingen van een beeld en beeld analyse door TA, klikt u op de "Save Fruit" te klikken. Alle actuele informatie, waaronder handmatige aanpassingen en geselecteerd voorwerpen, zullen worden opgeslagen in een nieuw bestand met dezelfde naam als van het originele beeld en een TMT extensie. Elke keer dat een bestand is geselecteerd, worden de opgeslagen TMT bestand met dezelfde naam automatisch worden geopend omdat het is gekoppeld aan het originele bestand. Toch moet de TMT-bestand worden opgeslagen in dezelfde map als het JPG-afbeelding (zie rubriek 4.1). Als de software niet de TMT-en jpg-bestanden op te slaan in dezelfde map, verplaats de afbeelding naar de map C schijf.
- Om terug te keren naar het oorspronkelijke afbeeldingsbestand, zonder dat een van de aanpassingen, gewoon verwijderen het bijbehorende TMT-bestand. Een alternatief is het selecteren van "analyseren" en Opnieuw analyseren de oorspronkelijke afbeelding. Er echter rekening mee dat elke TMT met dezelfde naam als het beeld nog steeds geassocieerd worden met het beeld dat de volgende keer dat het bestand wordt geopend, tenzij, natuurlijk, aanpassingen worden opgeslagen in de TMT-bestand.
- Exporteer data
- De gebruiker kan gegevens exporteren naar een afzonderlijke afbeelding door op de knop "Export". De gegevens worden geëxporteerd naar een Excel-bestand en weergeven van de attribuutwaarden voor elke vrucht, het gemiddelde en de standaarddeviatie.
- TA toepassing kan ook exporteren attribuutwaarden van twee of meer afbeeldingen ("Batch-analyse" functie).
- Om start de batch-analyse, klik op de "Open Image" knop.
- Selecteer de afbeelding bestanden die moeten worden batch geanalyseerd. Meerdere bestanden worden geselecteerd met de "Shift" of "Ctrl"-toets ingedrukt terwijl het selecteren van extra bestanden. Nadat de bestanden zijn geselecteerd, klikt u op de "Open"-toets.
- De gebruiker wordt gevraagd om het type van batch-analyse uitvoer te selecteren: "Gemiddeld Only", "gemiddelde en standaarddeviatie" of "individuele metingen per beeld". Een voorbeeld van de twee modi van uitvoer is weergegeven in figuur 6.
- Kies een naam voor het Excel-bestand dat zal worden aangemaakt en klik op "Opslaan"-toets. De software zal automatisch de bestanden openen en beginnen met de batch-analyse. Als het beeld bestanden zijn eerder geanalyseerd en opgeslagen door TA, zal de opgeslagen. TMT-bestanden worden geopend voor de batch-analyse. Als de bestanden niet eerder geanalyseerd, zal de software de analyse van de beelden uit te voeren zonder handmatige aanpassingen en deselections. TA kan uitvoeren een batch analyse van ten minste 100 afbeeldingen van 600 dpi.
- Batch-analyse voor de kleuranalyse. Open de "Color Test" optie onder het menu instellingen. Controleer de Batch Analyse en klik op Analyseren. Een nieuw venster zal verschijnen om de beelden te analyseren selecteren. In het volgende venster de naam en de directory voor het gegevensbestand. Klik op Opslaan. De output bestand bevat de naam van elke afbeelding (op basis van de bestandsnaam) en gemiddelde kleurwaarden voor iedere vrucht op de afbeelding. De parameters opgenomen bij de output zijn: een parameter, parameter 2, R, G en B-waarden, helderheid, L *, a * en b * waarden, evenals tint en chroma waarden. Kleur-test module kan doen een batch analyse van de maximaal 100 foto's fruit, afhankelijk van de hardware van de computer s.
8. Voorbeelden van data-analyse
De output gegenereerd door TA kan worden gebruikt voor vele toepassingen. In genetische studies, wordt de uitgang gebruikt om de vruchtvorm QTL (quantitative trait loci) te detecteren in een aantal populaties te scheiden van kruisingen tussen verschillende gecultiveerde tomatenrassen (S. Lycopersicum) en de wilde soorten S. pimpinellifolium toetreding LA1589 1,4,5. TA kan ook worden gebruikt om de vruchten in vorm categorieën 6 classificeren en te analyseren tomaten kleur verkleuring als gevolg van de fysiologische aandoening "gele schouder" 3. Bovendien is de software gebruikt om andere planten organen zoals bladeren 7 en zaden 8,9 analyseren.
9. Representatieve resultaten
De output van TA is gebruikt voor zeer uiteenlopende toepassingen. In vruchtvorm QTL studies, werden fruit afbeeldingen (8 tot 10 vruchten per plant in een afbeelding) verzameld uit een totaal van 96 tot 130 planten in een bepaalde bevolkingsgroep. Vervolgens werden deze beelden geanalyseerd door TA 4,5. Voor het detecteren van associatie tussen de fenotypen en genotypen, werden QTL-analyses uitgevoerd met behulp van composiet interval mapping 10,11 en door multitrait composiet interval mapping voor subsets van attributen in elke populatie 12. Als gevolg hiervan werden veel regio's van het tomatengenoom controle vruchtvorm geïdentificeerd. Sommige van deze regio's waren aanwezig in verschillende populaties, terwijl anderen die uniek zijn voor een bevolking. Terwijl sommige vruchtvorm QTLs (zoals ovaal, zon, en fs8.1) werden bekend zijn uit eerdere studies in kaart brengen, werden verschillende andere loci onlangs ontdekte. In totaal werden er 17 tot 36 QTLs controle vruchtvorm attributen aangetroffen in drie segregerende populaties 2,4.
De gegevens die door TA is ook geanalyseerd met behulp van Principal Components Analysis (PCA). In een studie werden vijftien vormkenmerken onderworpen aan PSO, en de eerste drie principale componenten (PC) werden vervolgens in kaart gebracht als eigenschappen. De gegevens tonen aan dat PC QTLs overlapt met attribuut QTLs die bijdragen aan de component 4. Scheiding van bevolkingsgroepen werden ook gebruikt om de QTL geïdentificeerd met morfometrie van de QTL geïdentificeerd met de vormkenmerken te vergelijken. Opnieuw werden de morfometrie QTL aangetoond dat samenvalt met QTL controle fruit vorm en grootte attributen in 93% van de gevallen 2. Deze resultaten tonen duidelijk de validiteit en reproduceerbaarheid van gegevens die door de TA in het analyseren van fruit morfologie.
Een andere toepassing van TA is het creëren van een vruchtvorm classificatiesysteem van tomaten cultivars op basis van objectieve vruchtvorm metingen te identificeren. Een germplasm collectie van ~ 350 tomaat toetredingen van diverse oorsprong en fruit morfologie werd geëvalueerd. Ongeveer acht fruit uit elke plant werden gedigitaliseerd en geanalyseerd met TA. Twee bestaande classificatiesystemen, IPGRI 13 en 14 UPOV, werden geëvalueerd en vergeleken met behulp van visuele vergelijkingen met fruit afbeeldingen in onze collectie. We pasten de morfologische indeling van deze twee systemen door het combineren van verschillende categorieën en door het creëren van twee nieuwe 6. Het proposed categorieën zijn plat, rond, lang, rechthoekig, obovoid, ellipsoïde, hart en oxheart. De acht nieuwe categorieën aangepast van de IPGRI 13 en de UPOV 14 systemen zijn meer visueel te onderscheiden, en werden getest met behulp van TA metingen. De TA output van 37 attributen van elke toetreding werd onderworpen aan PCA en Lineaire Discriminant Analyse (LDA) om de metingen die het beste elke vruchtvorm categorie te definiëren, en ook om te beoordelen hoe nauwkeurig de discriminator attributen de visuele classificatie van elke toetreding verklaren te identificeren. Een mogelijke toepassing van deze vrucht vorm classificatiesysteem zou zijn om de output van TA te gebruiken om cluster toetredingen op basis van fenotypische data, en identificeren van associaties tussen verschillende vruchtvorm categorieën.
De Color Test-module in de TA werd vergeleken met kleur metingen met een colorimeter (CR300) in een ingeteelde terugkruising (IBC) bevolking van kruisingen tussen S. lycopersicum verwerking cultivars 3. De L *, a * en b * waarden uit de colorimeter waren vergelijkbaar met kleur waarden verkregen uit drie verschillende scanners met TA. Er werden echter verschillen tussen de drie scanners waargenomen als gevolg van hardware, software of nonstandardized RGB-waarden. Bijgevolg werd een optie om correctie waarden in te voeren geïmplementeerd in Color Test om scanner kalibratie mogelijk te maken. In een genetische studie met behulp van Color Test van TA, de genetische variantie voor de kleur en uniformiteit was significant hoger dan wanneer deze waarden werden verkregen van een colorimeter. Deze verschillen zijn te wijten aan TA het meten van kleur parameters van een gehele oppervlak terwijl de colorimeter analyses slechts een paar punten op het oppervlak. Ten slotte werd TA getest en was in staat om kleur en uniformiteit te analyseren in andere gewassen zoals aardappel, komkommer, honingmeloen, en aardbei 3.
Figuur 1. Standaard Color Checker voor Color Test module om de kleur waarden verkregen uit verschillende scanners en op verschillende tijdstippen te kalibreren.
Figuur 2. Hoge kwaliteit gedigitaliseerd beelden zijn vereist voor het goed functioneren van de TA. A) Een voorbeeld van een lage kwaliteit beeld. TA zal proberen om objecten te vinden in de afbeelding. Wanneer er grote lege ruimtes, zoals hier wordt getoond, kan TA niet goed werken of crash. Sommige vruchten waren niet drooggedept, en het sap op de scanner scherm TA voorkomen dat herkenning van het juiste fruit grens. Ook, toen de meeste van de vruchten verkeerd zijn verticaal georiënteerd, zullen vele attributen niet correct worden berekend. Deze slechte kwaliteit foto's zal aanzienlijk vertragen de analyse van de vrucht vorm omdat uitgebreide handmatige aanpassingen die zullen moeten voorafgaand aan de analyse worden verricht. B) Een voorbeeld van een hoge kwaliteit beeld. De vruchten zijn verticaal in de juiste richting, afstand te sluiten terwijl niet raken elkaar en drooggedept.
Figuur 3. Schermafbeelding van de TA-software. Het bovenste venster toont de knoppen voor verschillende beschikbare tools (dat wil zeggen, open beeld, op te slaan fruit, export van gegevens, passen grootte, te analyseren en te herzien). Het object in de rechterbovenhoek venster is geselecteerd voor handmatige instellingen en de gegevens worden weergegeven in de rechterbenedenhoek venster. De waarden voor deze vrucht zijn grijs gemarkeerd in het onderste juiste gegevens venster. De objecten die in geel in het linker venster zal worden opgenomen in de analyses terwijl objecten die in blauw wordt niet opgenomen in de analyses.
Figuur 4. Een afbeelding gebruikt voor de Tomaat Analyzer - Color Test toepassing.
Figuur 5. Gebruiker gedefinieerde instellingen. A) blockiness attributen. De bovenste positie wordt gebruikt voor het proximale uiteinde blockiness en attributen driehoek te berekenen. De instelling voor Upper positie bepaalt waar X wordt gemeten (= 10% in de figuur). De onderste positie wordt gebruikt voor het distale einde blockiness en attributen driehoek te berekenen. De instelling voor lagere positie bepaalt waar Y is gemeten (= 90% in de figuur). De waarden voor deze posities gelijk zijn aan het percentage van de hoogte van de bovenkant van de vrucht. B) Macro hoek attributen. De groene lijnen geven percentage (= 20% in de figuur) langs de grens van het einde (zwarte vierkant in de figuur), waar de hoek wordt gemeten. De software bepaalt de helling met behulp van + / - 5% van de geselecteerde waarde. Voor de micro-hoeken van de software bepaalt de helling met behulp van + / - 2% van de geselecteerde waarde.
Figuur 6. Een voorbeeld van de output gegevens verkregen met Hulpprogramma voor het exporteren van de afbeelding zien in figuur 3. A) uitgang weergeven van de attribuutwaarden voor elke vrucht, het gemiddelde en de standaarddeviatie. B) Output het weergeven van de gemiddelde attribuut waarden en de standaarddeviatie voor 10 tomatenrassen.
| L * | een * | b * | |
| 1 | 37.986 | 13.555 | 14.059 |
| 2 | 65.711 | 18,13 | 17,81 |
| 3 | 49.927 | -4,88 | -21.925 |
| 4 | 43.139 | -13.095 | 21.905 |
| 5 | 55.112 | 8.844 | -25.399 |
| 6 | 70.719 | -33.397 | -0.199 |
| 7 | 62.661 | 36.067 | 57.096 |
| 8 | 40,02 | 10,41 | -45.964 |
| 9 | 51.124 | 48.239 | 16.248 |
| 10 | 30.325 | 22.976 | -21.587 |
| 11 | 72.532 | -23.709 | 57.255 |
| 12 | 71.941 | 19.363 | 67.857 |
| 13 | 28.778 | 14.179 | -50.297 |
| 14 | 55.261 | -38.342 | 31,37 |
| 15 | 42.101 | 53.378 | 28,19 |
| 16 | 81.733 | 4.039 | 79.819 |
| 17 | 51.935 | 49.986 | -14.574 |
| 18 | 51.038 | -28.631 | -28.638 |
| 19 | 96.539 | -0.425 | 1.186 |
| 20 | 81.257 | -0.638 | -0.335 |
| 21 | 66.766 | -0.734 | -0.504 |
| 22 | 50.867 | -0.153 | -0,27 |
| 23 | 35.656 | -0.421 | -1.231 |
| 24 | 20.461 | -0.079 | -0.973 |
Tabel 1. L *, a *, b * waarden voor elke patch van de Color Checker (zie figuur 1). De bron van de lichtbron was D50 en de waarnemer hoek werd 2 °.
Discussion
High-throughput en nauwkeurige evaluatie van plantaardige orgel morfologie en de kleur is moeilijk vanwege de kwantitatieve aard en vaak subjectief kwantificering. TA biedt objectieve en nauwkeurige metingen van verschillende fruit morfologische en colorimetrische eigenschappen in een high-throughput en semi-automatische manier. Het nut van TA is aangetoond in studies die leidde tot de identificatie van tomaten vorm QTL 2,4,5. Daarnaast is de indeling van cultivars6 en de taxonomie van een groep van soorten zijn beoordeeld aan de hand van de output van TA 15,16. Hoge expressie van de tomaat vruchtvorm gen zon resulteert in een langwerpige vruchten 17. Met behulp van TA, blad en cotyledon vorm werd bepaald in lijnen uitdrukken zon op een hoog niveau 7, waaruit blijkt dat de aanvraag effectief kan worden gebruikt om de morfologie van andere plantaardige organen te meten ook. Bovendien is TA is kritisch belang bij het identificeren van de genetische basis van zaad grootte in tomaat en zonnebloem 8,9. Ten slotte is de Color Test module geïmplementeerd in TA is meer precies en accuraat, en minder duur dan andere methoden om fruit kleur te analyseren in tomaat. Samengevat, is TA uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor de objectieve en betrouwbare evaluatie van de morfologie en de kleur variatie van planten organen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation (DBI 0227541).
References
- Brewer, M. T. Development of a controlled vocabulary and software application to analyze fruit shape variation in tomato and other plant species. Plant Physiol. 141 (1), 15-25 (2006).
- Gonzalo, M. J. Tomato Fruit Shape Analysis Using Morphometric and Morphology Attributes Implemented in Tomato Analyzer Software Program. Journal of the American Society for Horticultural Science. 134 (1), 77-87 (2009).
- Darrigues, A. Tomato analyzer-color test: A new tool for efficient digital phenotyping. Journal of the American Society for Horticultural Science. 133 (4), 579-586 (2008).
- Brewer, M. T., Moyseenko, J. B., Monforte, A. J., van der Knaap, E. Morphological variation in tomato: a comprehensive study of quantitative trait loci controlling fruit shape and development. J Exp Bot. 58 (6), 1339-1349 (2007).
- Gonzalo, M. J., Knaap, E. vander A comparative analysis into the genetic bases of morphology in tomato varieties exhibiting elongated fruit shape. Theor Appl Genet. 116 (5), 647-656 (2008).
- Rodríguez, G. R. Diversity of SUN, OVATE and FAS in the tomato germplasm and their effect on fruit morphology (in preparation. , Forth Coming Forthcoming.
- Wu, S. Masters Thesis. , The Ohio State University. (2009).
- Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genet. 5 (1), e1000347-e1000347 (2009).
- Yue, B., Cai, X., Yuan, W., Vick, B., Hu, J. Mapping quantitative trait loci (QTL) controlling seed morphology and disk diameter in sunflower (Helianthus annuus L). Helia. 32, 17-35 (2009).
- Zeng, Z. B. Theoretical Basis for Separation of Multiple Linked Gene Effects in Mapping Quantitative Trait Loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (23), 10972-10976 (1993).
- Zeng, Z. B. Precision Mapping of Quantitative Trait Loci. Genetics. 136 (4), 1457-1468 (1994).
- Jiang, C. J., Zeng, Z. B. Multiple-Trait Analysis of Genetic-Mapping for Quantitative Trait Loci. Genetics. 140 (3), 1111-1127 (1995).
- International Plant Genetic Resources Institute. IPGRI Descriptors for Tomato (Lycopersicon spp.). , Roma, Italy. 47-47 (1996).
- International Union for the Protection of New Varieties of Plants. UPOV Guidelines for the Conduct of Tests for Distinctness, Uniformity, and Stability. TOMATO (Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten Ex Farw.). , Geneva. 51-51 (2001).
- Depypere, L., Chaerle, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P. Stony endocarp dimension and shape variation in Prunus section Prunus. Annals of Botany. 100 (7), 1585-1597 (2007).
- Depypere, L., Chaerle, P., Breyne, P., Mijnsbrugge, K. V., Goetghebeur, P., P, A combined morphometric and AFLP based diversity study challenges the taxonomy of the European members of the complex Prunus L. section Prunus. Plant systematics and evolution. 279 (1-4), 219-231 (2009).
- Xiao, H., Jiang, N., Schaffner, E., Stockinger, E. J., van der Knaap, E. A retrotransposon-mediated gene duplication underlies morphological variation of tomato fruit. Science. 319 (5869), 1527-1530 (2008).
