Summary
Pomodoro Analyzer (TA) quantifica gli attributi di due forme dimensionali e di colore in modo riproducibile e accurato. Un passo-passo procedura per ottenere immagini di alta qualità digitalizzate di pomodori, le analisi morfologiche e colori di queste immagini e le diverse applicazioni utilizzando i dati generati da questo software sono descritte.
Abstract
Misura morfologia frutta e tratti a colori di colture vegetali e frutta in modo oggettivo e riproducibile è importante per la dettagliata analisi fenotipica di questi tratti. Pomodoro Analyzer (TA) è un programma software che misura 37 attributi relativi alla forma bidimensionale in un 1,2 modo semi-automatico e riproducibile. Molti di questi attributi, come gli angoli alle estremità distali e prossimali del frutto e le aree di rientro, sono difficili da quantificare manualmente. Gli attributi sono organizzati in dieci categorie all'interno del software: misurazione di base, Forma Indice di frutta, quadrettature, omogeneità, prossimale forma finale di frutta, distale Forma Fine Frutta, asimmetria, eccentricità interno, Sezione latitudine e Morfologia. L'ultima categoria non richiede né conoscenze pregresse né predeterminato di nozioni gli attributi della forma, così l'analisi morfometrica offre un'opzione imparziale che può essere meglio adattata ad alta velocità di analisi di analisi degli attributi. TA offre anche l'applicazione del test del colore che è stato progettato per raccogliere dati a colori dalle immagini acquisite e permettere la scansione dei dispositivi da calibrare con standard di colore 3.
TA fornisce diverse opzioni per esportare e analizzare la forma degli attributi, morfometrici, e dati a colori. I dati potranno essere esportati in un file excel in modalità batch (più di 100 immagini in una sola volta) o esportati come immagini singole. L'utente può scegliere tra l'uscita che visualizza la media per ogni attributo per gli oggetti in ogni immagine (tra cui deviazione standard), oppure un output che visualizza i valori degli attributi per ogni oggetto sull'immagine. TA è stato uno strumento prezioso ed efficace per identificando gli e confermando pomodoro frutta Quantitative Trait Loci forma (QTL), oltre a svolgere analisi approfondite degli effetti di geni chiave forma di frutta sulla morfologia delle piante. Inoltre, TA può essere utilizzato per classificare oggettivamente frutta in categorie varie forme. Infine, la forma di frutta e tratti a colori in altre specie vegetali così come di altri organi della pianta come foglie e semi possono essere valutati con TA.
Protocol
Pomodoro Analyzer (TA) il software è progettato per riconoscere gli oggetti di una certa dimensione e risoluzione dell'immagine, misurata in punti (pixel) per pollice (dpi). Il software determina automaticamente i limiti di frutta in un'immagine digitalizzata. Il confine oggetto è determinata attraverso contorno tracciato, che si traduce in un elenco di punti adiacenti descrivere il confine di un oggetto in un'immagine. Tutte le misure di frutta forma sono calcolati sulla base dei confini. Il test del colore modulo "Pomodoro di prova Analyzer colore" è stato progettato per quantificare i parametri di colore all'interno dei confini riconosciuti dal software. Le misurazioni del colore sono in base al colore dello spazio RGB: R (rosso), G (verde) e B (blu). I valori medi RGB di ogni pixel è presa dal modulo colore di prova e poi tradotto nello spazio colore CIELAB che usa L *, a *, b * per descrivere il colore in modo che approssima percezione visiva umana. Il modulo di prova colore calcola Hue e descrittori di colore Chroma base a * b *.
Un passo-passo protocollo è descritto per la digitalizzazione dei pomodori e la successiva semi-automatico di analisi della morfologia e gli attributi di colore utilizzando il pacchetto software TA. Il protocollo è suddiviso in otto fasi: raccolta di immagine 1) Selezione e preparazione del materiale vegetale, 2), 3) l'installazione del software, 4) analisi delle immagini e la calibrazione per il test dei colori TA, 5) Regolazione manuale di attributi, 6) User- impostazioni definite, 7) Salvataggio ed esportazione dei dati, e 8) Esempi di analisi dei dati.
1. Selezione e preparazione del materiale vegetale
- Frutta deve essere pulita e asciutta.
- Frutto carnoso non deve essere troppo maturo perché addolcimento può causare deformazioni forma quando si taglia il frutto.
- Tagliare la frutta con un coltello affilato o dentata, una lama di rasoio nuovo. A seconda del tipo di analisi e gli attributi da valutare, la frutta deve essere tagliato longitudinalmente o trasversalmente attraverso il centro. Analisi del colore può essere applicata a tagliare longitudinalmente o trasversalmente frutta, nonché altre sezioni progettate per evidenziare caratteristiche specifiche.
- Asciugare la parte interna del frutto tamponando con salviette di tessuto o di carta, se il frutto è molto succoso.
2. Collezioni di immagini
- Taglio di frutta e posto sullo scanner con la parte tagliata verso il basso. Posizionare un righello sopra e una sotto l'etichetta di frutta. Il righello è utilizzato per verificare che la risoluzione di scansione corretta è stato selezionato, ed è importante per la misurazione accurata degli attributi di frutta. Per high-throughput analisi dei dati, è essenziale per eseguire la scansione di frutta da un solo impianto (o genotipo) alla volta e di eseguire la scansione di frutta che può essere tagliato longitudinalmente o trasversalmente, ma non una miscela di entrambi sulla stessa scansione. Luogo frutti vicini tra loro, ma evitare di dover toccare adiacente frutta. Evitare anche grandi spazi vuoti tra i frutti dello scanner. Se gli oggetti sono troppo distanti l'uno dall'altro, l'immagine deve essere manipolato mediante software di imaging come Adobe Photoshop o GIMP prima dell'analisi con TA.
- Poiché il software utilizza la risoluzione dell'immagine TA per misurare con precisione le dimensioni, corretta selezione della risoluzione di scansione è importante per una successiva analisi.
- Come regola generale, se gli oggetti sono compresi tra 1 e 8 cm, la scansione a 200 o 300 dpi (pixel / pollice). Se gli oggetti sono> 8 cm, la scansione a 100 dpi. Per oggetti molto piccoli (<1 cm), come i semi, la scansione a 750 dpi o superiore. Quando l'analisi dei lotti è prevista (vedi sotto) e la dimensione del frutto non è molto variabile tra le diverse piante, è conveniente scegliere una impostazione della risoluzione dello scanner per tutte le immagini da raccogliere per lo stesso esperimento.
- Per la prova colore, impostare la risoluzione dello scanner a 200 dpi se i frutti sono <8 cm. Se i frutti sono> 8 cm, la scansione a 100 dpi. Inoltre, impostare le dimensioni dell'immagine di uscita al maggior numero di colori disponibili nello scanner.
- Gli oggetti devono essere acquisiti con uno sfondo nero o molto scuro per impedire le ombre che interferiscono con l'analisi. Uno sfondo scuro può essere ottenuto mettendo una scatola di cartone sopra lo scanner in modo che tutta la luce è limitata dallo schermo. Se uno sfondo bianco viene utilizzato, TA non riuscirà a funzionare perché l'applicazione è ottimizzata per l'utilizzo di uno sfondo scuro.
- L'immagine deve essere ritagliata dopo la scansione iniziale (prima di salvare l'immagine) per evitare di ampi spazi vuoti. Se l'immagine non viene tagliata in questa fase, deve essere ritagliata con il software di imaging come Adobe Photoshop o GIMP prima dell'analisi con TA.
- Per le analisi del colore, lo scanner dovrà essere calibrato se l'utente intende tradurre i valori RGB per la universale L *, a * b * scala. La scansione del correttore colore (figura 1) dovrebbe avvenire prima o durante la scansione dei frutti. Il controllo del colore, scansione deve essere salvato nella stessa cartella delle immagini di frutta. Calibrazione dello scanner è necessario perché scanner differiscono nel modo in cui cattura il colore data e la sorgente di luce può cambiare nel tempo con l'uso ripetuto.
- Ottenere standard di colore e scansione. Colore norme devono essere scelti in base alla vasta gamma di colori osservati nella coltura di interesse. Per questo esempio, abbiamo scelto uno standard di 24 colori carta resa (ColorChecker, X-Rite, Grand Rapids, MI, Figura 1). Eseguire la scansione del controllo del colore, come si farebbe con la scansione dei frutti. Calibrazione dello scanner è spiegato nella sezione 4.7.
- Salvare l'immagine acquisita come file JPEG.
Nota: attento e preciso quando si posiziona gli oggetti sullo scanner durante la fase di raccolta di immagini. Il meglio gli oggetti sono allineati, la regolazione manuale meno sarà necessario quando si analizza il frutto di TA. Esempi di immagini di qualità bassa e alta sono mostrati in figura 2.
3. L'installazione del software
- Pomodoro Analyzer (TA) versione 2.2.0.0 può essere scaricata dal http://www.oardc.osu.edu/vanderknaap/tomato_analyzer.htm . L' Analizzatore Manuale Utente pomodoro e l'analizzatore di pomodoro a colori manuale del test sono disponibili anche da questo sito.
- TA richiede un sistema operativo Windows (versione 2000 o superiore).
4. Immagine di analisi e di calibrazione per il test dei colori TA
- La cartella con le immagini devono essere immessi sul disco rigido e non nella cartella "Documenti" o su un server remoto. Altrimenti, TA non salverà le immagini regolati nella stessa cartella delle immagini originali. Garantire che le immagini regolati con l'estensione. TMT sono nella stessa cartella dell'originale. Jpg (vedi punto 6.1.1).
- Lanciare il programma TA come qualsiasi altra applicazione software facendo doppio clic sull'icona.
- L'utente deve impostare il dpi e unità di misura per l'impostazione appropriata, selezionando "Scanner DPI" dal menu "Impostazioni". L'impostazione dpi deve essere lo stesso del file immagine in modo che la misurazione delle dimensioni (altezza, larghezza, perimetro, area) sono precisi. L '"Unità usato" nella finestra di dialogo determina le unità (cm, mm, in, o pixel) per l'uscita dei dati. Nella stessa finestra di dialogo, la luminosità può essere necessario un aggiustamento quando gli oggetti sono relativamente scuri.
Nota: il DPI e le unità possono essere regolati anche dopo le regolazioni manuali o dopo l'analisi delle immagini. - L'utente può selezionare gli attributi da misurare selezionando "misura salvato" dal menu "Impostazioni". Questo può essere fatto in qualsiasi momento durante o dopo l'analisi. Gli attributi sono raggruppati in dieci categorie (ad esempio di misura di base, Forma Indice di frutta, quadrettature, omogeneità, prossimale forma finale di frutta, distale Forma Fine Frutta, asimmetria, eccentricità interno, Sezione latitudine e Morfologia). Singoli attributi o un intero gruppo di misura può essere selezionata o deselezionata cliccando sul gruppo o attributo. Tutti gli attributi di un gruppo di misurazione possono essere visualizzati cliccando sul "+". Gli attributi selezionati vengono visualizzati per categoria nella finestra in basso a destra dello schermo, come mostrato nella Figura 3.
- Per iniziare, clicca sul "Apri immagine" e selezionare il file immagine dal menu pop-up nella finestra di dialogo. L'immagine selezionata verrà visualizzata nella finestra di sinistra.
- Per analizzare l'immagine aperta, fare clic sul pulsante "Analizza". Al termine, il perimetro di ogni frutto sarà evidenziato con una linea gialla ed i dati saranno visualizzati nella finestra in basso a destra dei dati. Il software automaticamente deselezionare oggetti molto grandi o piccoli, come un righello o l'etichetta. Gli oggetti deselezionato sarà evidenziato con una linea blu. Frutta addizionali possono essere deselezionate facendo clic destro sulla loro immagine. Solo gli elementi in giallo vengono visualizzati nella finestra dei dati ed esportati (Figura 3). Articoli delineate nel blu non saranno inclusi nelle analisi. Singoli oggetti vengono visualizzati nella finestra in alto a destra facendo clic su di esse con il mouse.
Nota: I dati del modulo di prova colore non vengono visualizzati nella finestra in basso a destra dei dati. - Analizzare il controllo del colore, per l'analisi del colore.
- Controllo del colore, e la raccolta di L *, a *, b * Valori. Aprire l'immagine digitalizzata controllo del colore, e analizzare come descritto per la frutta. Assicurarsi TA riconosce ogni patch come un oggetto da analizzare (contorno giallo). Se si utilizza un correttore colore standard, il software non può essere in grado di riconoscere le andane più scuro. Questi colori non saranno inclusi nella calibrazione. Nel menu Impostazioni, selezionare "Test Colore". La finestra di dialogo. Assicurarsi che i valori di correzione sono impostati a 1 per la pendenza (box a sinistra) e 0 per il intercetta di y (box a destra). Valore minimo blu deve essere impostato a 0, e dei parametri 1 e 2 possono essere ignorati. Fare clic sul pulsante Analizza all'interno della finestra di dialogo dei colori di prova. Una nuova finestra per salvare °uscita e come un documento "CSV" che può essere aperto in Excel. Specificare il nome e la directory per il file di dati. Il file di dati di output conterrà i valori RGB; L *, a *, b * valori, e calcoli per tonalità e saturazione per ogni campione di colore.
- Determinare i valori di correzione per la calibrazione. Plot L *, a *, b * valori per ogni campione di colore rispetto ai valori colorimetro per L *, a *, e * b che sono disponibili dal produttore del correttore colore o nella tabella 1. Determinare l'equazione di regressione e registrare la pendenza e intercetta di y per ogni parametro. Nella finestra di dialogo, immettere l'inverso della pendenza e il contrario del segno della y intercetta valore per L *, a *, b *. Questi valori sono utilizzati come valori di correzione per il "Color Test" impostazioni.
- Prova a colori permette all'utente di definire i due parametri che la relazione della proporzione (%) dei pixel che rientrano in intervalli specificato di valori di tonalità scelta. Per l'analisi di pomodoro, per esempio, i valori inferiori e superiori per il parametro 1 sono rispettivamente 70 e 100, che corrispondono a indesiderabili colore polpa gialla e verde-giallo. I valori inferiori e superiori per il parametro 0 e 2 sono 50 e corrispondono al colore desiderato rosso. Salvare le impostazioni per questi valori. Questi valori saranno applicati a tutte le immagini che vengono analizzate fino a quando il programma viene chiuso. Per le immagini acquisite, selezionare la "illuminante C 2 °" opzione. Il "illuminante D65 10 °" opzione viene applicata solo per le immagini acquisite in luce naturale.
- Visualizzazione dei risultati (vedi figura 3): Ogni riga di dati in basso a destra della finestra di dati corrisponde a un particolare oggetto nell'immagine. I dati vengono visualizzati nello stesso ordine degli oggetti nell'immagine. La prima riga visualizza i valori per l'oggetto in alto a sinistra e l'ultima riga di dati vengono visualizzati i valori per l'oggetto nell'angolo in basso a destra dell'immagine. Cliccare su una riga per visualizzare i frutti corrispondente nella finestra in alto a destra. In alternativa, fare clic su un frutto e la riga corrispondente dati saranno evidenziati. Facendo clic sulla scheda attributi nella finestra in basso a destra è possibile vedere come l'attributo viene misurata per ogni frutto particolare. Per esempio, cliccando su angolo distale, l'angolo misurato dal software sulla frutta nella finestra di sinistra sarà mostrato. Questa funzione è molto utile per identificare gli oggetti che richiedono una regolazione manuale per una misurazione più accurata.
La Figura 4 mostra una immagine di analizzare con il modulo di prova colore. Tuttavia, i risultati non si vedono nella finestra dei dati. I dati possono essere raggiunte solo in un file di Excel dopo l'analisi viene salvato.
5. Regolazione manuale degli attributi
A volte il confine del frutto e le estremità prossimale e distale non si trovano correttamente da TA. Inoltre, se la frutta sono disposti ad angolo sullo scanner, l'immagine deve essere aggiustata per ottenere misurazioni corrette. Queste e altre caratteristiche possono essere corrette attraverso la regolazione manuale delle immagini dopo l'analisi iniziale. Le regolazioni disponibili appaiono sotto il pulsante "Aggiorna" menu e comprendono: Ruota, contorno, estremità prossimale, distale, Auto-ruotare, regolare Ellisse, Regolare Protrusione distale, Regolare Boundary pericarpo, contorno di default pericarpo.
Nota: Se le regolazioni devono essere fatte, prima regolare il confine, seguita dalla rotazione. Tutte le altre modifiche possono essere effettuate in qualsiasi ordine seguendo queste due regolazioni. Un adeguamento selezionati nell'ambito del Rivedere menù rimane selezionata fino a quando una regolazione diversa è scelto. Questo permette all'utente di eseguire la regolazione stesso su una sequenza di fette cliccando sull'immagine fetta e facendo clic sul pulsante Rivedi. Sotto, regolazioni manuali sugli attributi di frutta diverse sono dettagliate.
- Confine
- Sinistra cliccare sul frutto nella finestra di sinistra. Apparirà nella finestra in alto a destra.
- Fare clic sulla freccia accanto al pulsante "Aggiorna" e selezionare "confine" dal menu a tendina in alto a destra della finestra. Selezionare la posizione di confine di essere modificati da sinistra cliccando sul punto di partenza e punto finale del confine errato. Di conseguenza, il confine delimitato saranno rimossi.
- Per aggiungere un nuovo confine, clicca dal punto di partenza verso il punto finale. Continuate a fare clic per seguire il contorno desiderato. Fare clic destro annulla una modifica precedente. Modifiche multiple può essere annullata consecutivi click destro.
- Per confermare il nuovo confine, premere il tasto "Enter". Altrimenti, premere il tasto "Esc" per annullare l'operazione.
- Clicca su "Boundary Reset" per tornare all'impostazione originale confine.
- Ruota. Questa funzione viene utilizzata quando un oggetto non è completamente verticale.
- Clicca sulla frutta appropriato nella finestra di sinistra. Apparirà in alto a destra della finestra.
- Fare clic sulla freccia accanto al pulsante "Aggiorna" e selezionare "Ruota"dal menu a tendina.
- Un asse sarà visualizzato in alto a destra della finestra. Trascinare il quadrato verde alla fine dell'asse e il frutto ruoterà di conseguenza.
- Fare doppio clic all'interno della finestra o premere il tasto "Enter" per terminare.
- Clicca su "Rotazione Reset" per tornare alla allineamento originale.
- Regolare prossimale. Se c'è un errore nella posizione di fine prossimale, le misure derivanti da questa funzione non sarà corretto. Selezionare un frutto che richiede regolazioni in modo che appaia nella finestra a destra. Avanti, selezionare l'opzione "prossimale fine frutta forma" e la scheda "prossimale angolo di micro o macro" nella sezione dati in uscita sotto il frutto selezionato. Gli angoli prossimale verrà mostrata per ogni frutto nell'immagine a sinistra. In questo modo, gli angoli che sembrano insolito possono essere identificati. Per cambiare la posizione della fine prossimale, attenersi alla seguente procedura:
- Clicca su i frutti desiderati nella finestra di sinistra. Apparirà nella finestra in alto a destra.
- Fare clic sulla freccia accanto al pulsante "Aggiorna" e selezionare "Fine prossimale" dal menu a tendina.
- Nell'angolo in alto a destra della finestra, fare clic e trascinare l'indicatore di vertice nella posizione corretta.
- Fare doppio clic o premere il tasto "Enter" per terminare.
- Regolare distale. La posizione dell'estremità distale dell'oggetto può essere anche modificato manualmente. Per trovare in modo efficiente frutta che hanno bisogno di aggiustamenti distale, seguire la stessa procedura per l'estremità prossimale.
- Clicca su i frutti desiderati nella finestra di sinistra. Apparirà nell'angolo in alto a destra.
Fare clic sulla freccia accanto al pulsante "Aggiorna" e selezionare "distale" dal menu a tendina. - Nell'angolo in alto a destra della finestra, fare clic e trascinare l'indicatore di vertice nella posizione corretta.
- Fare doppio clic o premere il tasto "Enter" per terminare.
- Clicca su i frutti desiderati nella finestra di sinistra. Apparirà nell'angolo in alto a destra.
- Fine sporgenza distale. Questa funzione consente all'utente di definire i punti finali al limite della punta.
- Nella sezione "distale End Frutta Shape", selezionare la colonna etichettata "sporgenza distale End" e selezionare l'oggetto da regolare.
- Fare clic sulla freccia accanto al pulsante "Aggiorna" e seleziona "Regola Sporgenza distale" dal menu a discesa.
- Trascinare i punti che appaiono nelle posizioni desiderate lungo il confine.
- Premere il tasto Invio per terminare. Una linea apparirà mostrando il taglio della zona punta e ricalcolare la zona punta. I risultati verranno visualizzati nella colonna distale sporgenza finale. Se l'area punta non è nella posizione desiderata, selezionando "Ripristina Protrusione distale" sotto il tasto "Aggiorna" ripristina i punti alle loro posizioni iniziali. Se una zona punta è trovato ma non dovrebbe esistere, selezionando "Eliminare Sporgenza distale" dal tasto "Aggiorna" si muoveranno i punti di fondo della frutta, per un valore di 0.0 per la "distale sporgenza End" colonna.
- La rotazione automatica. Questa funzione è specificamente sviluppato per i semi di pomodoro in modo che possano essere automaticamente allineato con l'estremità appuntita verso la stessa direzione. A questo punto, la rotazione automatica non funziona su altri oggetti come la frutta.
- Regolare ellisse. Questa funzione consente all'utente di ridimensionare e / o spostare l'ellisse interna per definire le aree di frutta interno. Questo attributo viene utilizzato per la funzione Eccentricità interno e forma di frutta attributo indice interno di TA.
- Selezionare la scheda interna Eccentricità, quindi selezionare una delle colonne nella scheda. Selezionare una "dimensione ellisse di default" dal menu "Impostazioni".
- Selezionare un oggetto, e fare clic sul pulsante "Aggiorna". Selezionare "Regola Ellisse" dal menu a discesa.
- Due punti apparirà rappresentano i punti superiore e sinistro dell'ellisse. Spostandoli sia ridimensiona e ri-centrare l'ellisse rispetto ai due nuovi punti.
- Una volta che questi punti sono stati impostati per la loro posizione desiderata, premere il tasto Invio. L'ellisse sarà ridisegnata. Se la posizione è accettabile, premere di nuovo Invio e dei valori nelle colonne verrà aggiornato.
- Se l'ellisse interna deve essere spostato senza essere rimodellati, clicca sul centro degli oggetti, dove i punti sono stati. Due linee e tre punti di verde apparirà. Spostare il punto posizionato circa al centro del frutto in una nuova posizione per spostare l'ellisse senza ridimensionarlo.
- Premere Invio per terminare.
- Regolare confine pericarpo. Questa funzione consente all'utente di definire la regione pericarpo e deve essere rettificato quando zona Pericarpo "e" spessore pericarpo "sono selezionati nel" latitudinale "linguetta della sezione.
Nota: per la frutta che sono troppo mature, può essere difficile o impossibile distinguere il pericarpo dal resto del frutto.- Selezionare un oggetto, e fare clic sul menu "Rivedere" giù menu. Seleziona "confine di default pericarpo" e impostare il valore predefinito che si adatta meglio del pericarpo.
- Per ulteriori regolazioni, selezionare "Regola confine pericarpo" dal menu "Aggiorna" discesa.
- Nell'angolo in alto a destra della finestra, selezionare la posizione di confine pericarpo che deve essere modificato. Questo si ottiene cliccando sulla sinistra il punto iniziale e punto finale del confine errato. Di conseguenza, il confine delimitato saranno rimossi. Per il miglior risultato, la sezione più piccola possibile di confine deve essere selezionato in qualsiasi momento.
- Per aggiungere un nuovo confine, clicca dal secondo punto di nuovo al primo punto. Continuate a fare clic per seguire il contorno desiderato. Fare clic destro annulla una modifica precedente. Modifiche multiple può essere annullata consecutivi click destro.
Nota: Troppe modifiche al contorno pericarpo può causare crash del programma. - Per confermare nuovo confine, premere il tasto "Enter". Altrimenti, premere il tasto "Esc" per annullare l'operazione.
- Selezionare "Ripristina Pericarpo confine" per tornare al confine nella sua posizione originale.
- Per l'analisi del colore, quando il confine della carne non è al bordo dell'immagine frutta (ad esempio, un taglio trasversale alla spalla di frutta, mostrando la buccia del frutto di sopra del taglio trasversale, come mostrato nella Figura 4), l'utente ha bisogno di aprire il "Test del colore" nella finestra di dialogo nel menu "Impostazioni". In questa finestra di dialogo, il valore minimo blu deve essere impostata a 30 e salvati. Se i frutti sono <3 cm, impostare il valore minimo blu a 20. Questo valore potrebbe essere necessario essere ulteriormente corretto se TA ha problemi a trovare i confini corretti.
6. Impostazioni definite dall'utente
Per alcuni attributi, l'utente deve selezionare le impostazioni in cui la misura deve essere effettuata. Questo può essere fatto prima o dopo l'analisi e dipenderà se un esperimento è da ripetere con le stesse impostazioni come erano utilizzati in precedenza o se l'utente vuole fare analisi esplorative al fine di definire l'impostazione appropriata per la nuova analisi.
- Impostazione di blocchizzazione distale e prossimale. Blocchizzazione è calcolato come il rapporto tra la larghezza ad una selezionata dall'utente proporzione l'altezza più vicina alla fine distale / prossimale del frutto a metà larghezza (Figura 5A). Ciò consente all'utente di selezionare o modificare la posizione dell'oggetto in cui è presa la misura. Le posizioni blocchizzazione superiori ed inferiori possono essere modificati inserendo un nuovo valore nella "posizione blocchizzazione" sotto il pulsante "Impostazioni".
- Regolazione degli angoli di micro e macro. Queste impostazioni vengono utilizzate per calcolare gli angoli in posizioni diverse dalle estremità del frutto (Figura 5B). L'impostazione macro è in genere utilizzato per angoli da 5 al 40% lungo il confine e l'impostazione micro serve 2 al 10% lungo il confine.
- Numero di punti morfometrici. Questa funzione trova punti lungo il confine di ogni oggetto a immagine caricata. Le estremità distali e prossimali sono usati come punti di riferimento per tutti gli oggetti nell'immagine. Il numero di punti misurata lungo il confine può essere selezionata "# di punti morfometriche" nel menu "Impostazioni". Tra 4 e 30 punti possono essere selezionati. Il software automaticamente dividere il numero di punti selezionati a metà e li distribuiscono in modo uniforme su ogni lato del frutto tra le estremità distali e prossimali.
7. Salvataggio ed esportazione dei dati
- Salvare i dati
- Dopo la regolazione manuale di analisi delle immagini e l'immagine da TA, clicca su "Fruit Salva". Tutte le informazioni attuali, comprese le regolazioni manuali e oggetti deselezionata, verrà salvato in un nuovo file con lo stesso nome dell'immagine originale e un'estensione tmt. Ogni volta che si seleziona un file, il file salvato TMT con lo stesso nome verrà automaticamente aperto perché è legato al file originale. Tuttavia, il file TMT deve essere conservato nella stessa cartella del file immagine jpg (vedere paragrafo 4.1). Se il software non memorizza i file tmt e jpg nella stessa cartella, spostare la cartella delle immagini sul disco C.
- Per ripristinare il file immagine originale, senza alcuna delle rettifiche, è sufficiente eliminare il file associato tmt. Un'alternativa è quella di selezionare "Analizza" e rianalizzare l'immagine originale. Tuttavia, essere consapevoli che qualsiasi tmt con lo stesso nome l'immagine sarà ancora associata con l'immagine la prossima volta che il file viene aperto meno che, naturalmente, le regolazioni vengono salvate sul file tmt.
- Esportazione dei dati
- L'utente può esportare i dati per una singola immagine selezionando il tasto "Esporta". I dati saranno esportati in un file Excel e visualizzare i valori degli attributi per ogni frutto, la media e la deviazione standard.
- Applicazione TA inoltre possibile esportare i valori degli attributi da due o più immagini ("Analisi batch" funzione).
- Per STArt l'analisi batch, fare clic su "Apri immagine" pulsante.
- Selezionare i file immagine da lotto analizzato. Sono selezionati più file utilizzando il "Shift" o "Ctrl", mentre la selezione dei file aggiuntivi. Dopo che i file sono selezionati, fare clic sul tasto "Apri".
- L'utente verrà chiesto di selezionare il tipo di uscita batch analisi: "Solo i media", "media e deviazione standard" o "misure individuali per immagine". Un esempio di due modalità di esportazione è mostrata in Figura 6.
- Scegliere un nome per il file Excel che verrà creato e cliccare sul tasto "Salva". Il software si aprirà automaticamente i file e iniziare l'analisi batch. Se i file di immagine sono stati precedentemente analizzati e salvati da TA, i file salvati. Tmt sarà aperto per l'analisi dei lotti. Se i file non sono stati precedentemente analizzati, il software esegue l'analisi delle immagini senza regolazioni manuali e deselezioni. TA possibile eseguire una analisi dei lotti di almeno 100 immagini a 600 dpi.
- Analisi dei lotti per l'analisi del colore. Aprire il "Test del colore" opzione nel menu impostazioni. Controllare l'analisi batch e fare clic su Analizza. Una nuova finestra per selezionare le immagini da analizzare. Nella finestra successiva specificare il nome e la directory per il file di dati. Fare clic su Salva. Il file di output conterrà il nome di ogni immagine (in base al nome del file) e valori di colore media per ogni frutto sull'immagine. I parametri inclusi nell'output sono: parametro 1, parametro 2, R, G, B e valori, la luminosità, L *, a *, b * I valori, così come valori di tonalità e saturazione. Test di modulo colore può fare un'analisi lotto di fino a 100 immagini frutta, a seconda dell'hardware del computer s.
8. Esempi di analisi dei dati
L'output generato da TA può essere utilizzato per molte applicazioni. Negli studi genetici, l'uscita è utilizzato per rilevare la forma di frutta QTL (Quantitative Trait Loci) in diverse popolazioni segreganti derivate da incroci tra diverse varietà di pomodoro coltivata (S. Lycopersicum) e le specie selvatiche S. pimpinellifolium adesione LA1589 1,4,5. TA può anche essere usato per classificare i frutti in forma categorie 6 e analizzare frutta scolorimento pomodoro colore a causa del disordine fisiologico "spalla giallo" 3. Inoltre, il software è stato utilizzato per analizzare altri organi della pianta come foglie 7 e semi di 8,9.
9. Rappresentante Risultati
L'uscita di TA è stata utilizzata per le applicazioni molto varie. Gli studi in forma di frutta QTL, immagini di frutta (8 a 10 frutti per pianta in una sola immagine) sono stati raccolti da un totale di 96-130 piante in ogni popolazione. Successivamente, queste immagini sono state analizzate da TA 4,5. Per rilevare l'associazione tra genotipi e fenotipi, analisi QTL sono state effettuate utilizzando la mappatura intervallo composito 10,11 e dalle mappatura intervallo multitrait composito per sottoinsiemi di attributi in ogni popolazione 12. Come risultato, molte regioni del genoma forma pomodoro frutto controllo sono stati identificati. Alcune di queste regioni erano presenti in diverse popolazioni, mentre altri erano unici a una popolazione. Mentre alcuni QTL forma di frutta (come ovate, sole, e fs8.1) erano conosciuti da studi di mappatura precedenti, molti altri loci sono stati di recente scoperta. In totale, 17-36 QTL controllare attributi forma di frutta sono stati individuati in tre popolazioni segreganti 2,4.
Dati generati da TA è stata anche analizzata utilizzando Analisi delle Componenti Principali (PCA). In uno studio, quindici attributi forma sono stati sottoposti a PCA, e le prime tre componenti principali (PC) sono stati successivamente mappati come tratti. I dati mostrano che QTL PC sovrapposti con QTL attributo che stavano contribuendo alla componente 4. Popolazioni segreganti sono stati utilizzati anche per confrontare i QTL identificati con morfometria al QTL identificati con gli attributi della forma. Ancora una volta, la morfometria QTL sono state mostrate in concomitanza con QTL forma di frutta di controllo e gli attributi di dimensione nel 93% dei casi 2. Questi risultati dimostrano chiaramente la validità e la riproducibilità dei dati prodotti da AT nell'analisi morfologia frutta.
Un'altra applicazione di TA è la creazione di un sistema di classificazione di frutta forma di individuare cultivar di pomodoro sulla base di misurazioni oggettive forma di frutta. Una collezione di germoplasma di pomodoro ~ 350 adesioni di diversa origine e la morfologia di frutta è stata valutata. Circa otto frutta da ogni pianta sono stati digitalizzati e analizzati con TA. Due sistemi di classificazione esistenti, IPGRI UPOV 13 e 14, sono stati valutati e confrontati con i confronti visivi per immagini frutto della nostra collezione. Abbiamo modificato la classificazione morfologica di questi due sistemi, combinando diverse categorie e con la creazione di due nuovi 6. Il prcategorie oposed sono piatte, rotondo, lungo, rettangolare, obovoid, ellissoide, cuore e oxheart. Le otto nuove categorie adattato dal IPGRI UPOV 13 e 14 sistemi sono più visivamente distinguibili, e sono stati testati utilizzando le misurazioni TA. L'uscita AT di 37 attributi di ogni adesione è stato sottoposto a PCA e Analisi Discriminante Lineare (LDA) per identificare le misure che meglio definiscono ciascuna categoria di forma di frutta, e anche per valutare con precisione gli attributi discriminatore spiegare la classificazione visuale di ciascuna adesione. Una possibile applicazione di questo sistema di classificazione frutto forma sarebbe quella di utilizzare l'uscita di AT alle adesioni di cluster basati su dati fenotipici e identificare associazioni tra categorie diverse forme di frutta.
Il modulo di prova colore a TA è stato confrontato con le misurazioni a colori scattata con un colorimetro (CR300) in un inbred backcross (IBC) della popolazione derivate da incroci tra S. cultivar di elaborazione lycopersicum 3. L *, a *, b * e valori dal colorimetro erano paragonabili a valori di colore ottenuti da tre diversi scanner con TA. Tuttavia, le differenze tra i tre scanner sono stati osservati a causa di hardware, software, o non standardizzato dei valori RGB. Di conseguenza, la possibilità di inserire i valori di correzione è stata implementata in prova colore per permettere la calibrazione dello scanner. In uno studio genetico utilizzando il test del colore da TA, la varianza genetica per colore e uniformità del colore era significativamente più alta rispetto a quando questi valori sono stati ottenuti da un colorimetro. Queste differenze sono dovute a parametri di colore TA di misura di una superficie, mentre il colorimetro analizza solo alcuni punti sulla superficie. Infine, AT è stato testato ed è stato in grado di analizzare il colore e uniformità del colore in altre colture come patata, cetriolo, melone, fragole e 3.
Figura 1. Controllo del colore, standard per il modulo di colore di prova per calibrare i valori di colore ottenute da scanner differenti e in tempi diversi.
Figura 2. Immagini di alta qualità digitalizzati sono necessari per il corretto funzionamento del TA. A) Un esempio di un'immagine di bassa qualità. TA tenterà di trovare gli oggetti di tutta l'immagine. Quando ci sono grandi spazi vuoti, come mostrato qui, TA potrebbe non funzionare correttamente o crash. Alcuni frutti non sono stati cancellati a secco, e il succo sullo schermo dello scanner impedirà TA di riconoscere il limite corretto di frutta. Inoltre, quando la maggior parte dei frutti sono orientati verticalmente in modo non corretto, molti attributi non vengono calcolati in modo corretto. Queste immagini di scarsa qualità sarà rallentare in modo significativo l'analisi della forma di frutta a causa di ampie regolazioni manuali che dovranno essere effettuate prima dell'analisi. B) Un esempio di un'immagine di alta qualità. I frutti sono orientati verticalmente correttamente, vicino distanziati senza toccare l'altro e asciugate.
Figura 3. Screen shot del software di TA. La finestra superiore mostra i pulsanti per diversi strumenti disponibili (ad esempio, l'immagine aprire, salvare frutta, esportazione dei dati, la dimensione adatta, analizzare e rivedere). L'oggetto in alto a destra della finestra è stato selezionato per regolazioni manuali ei dati vengono visualizzati nella finestra in basso a destra. I valori di questo frutto sono evidenziate in grigio in basso a destra della finestra dei dati. Gli oggetti in giallo nella finestra di sinistra saranno inclusi nelle analisi mentre gli oggetti descritti in blu non saranno inclusi nelle analisi.
Figura 4. L'immagine utilizzata per l'analizzatore di Pomodoro - Prova di applicazione del colore.
Figura 5. Impostazioni definite dall'utente. A) attributi blocchizzazione. La posizione superiore viene utilizzato per calcolare blocchizzazione prossimale fine e gli attributi triangolo. L'impostazione per la posizione superiore determina dove X è misurato (= 10% in figura). La posizione più bassa è utilizzata per calcolare blocchizzazione distale fine e gli attributi triangolo. L'impostazione per la Bassa posizione determina dove Y è misurato (= 90% in figura). I valori di queste posizioni uguale la percentuale di altezza dalla sommità del frutto. B) attributi angolo Macro. Le linee verdi rappresentano percentuale (= 20% in figura) lungo il confine a partire dalla fine (quadrato nero in figura) dove l'angolo sarà misurato. Il software determina la pendenza con + / - 5% del valore selezionato. Per gli angoli micro il software determina la pendenza con + / - 2% del valore selezionato.
Figura 6. Un esempio di dati in uscita ottenuto con lo strumento di esportazione dall'immagine mostrato nella Figura 3. A) Uscita visualizzare i valori degli attributi per ogni frutto, la media e la deviazione standard. B) Uscita visualizzare i valori degli attributi media e la deviazione standard di 10 varietà di pomodoro.
| L * | A * | b * | |
| 1 | 37,986 | 13,555 | 14,059 |
| 2 | 65,711 | 18,13 | 17,81 |
| 3 | 49,927 | -4,88 | -21,925 |
| 4 | 43,139 | -13,095 | 21,905 |
| 5 | 55,112 | 8,844 | -25,399 |
| 6 | 70,719 | -33,397 | -0,199 |
| 7 | 62,661 | 36,067 | 57,096 |
| 8 | 40,02 | 10,41 | -45,964 |
| 9 | 51,124 | 48,239 | 16,248 |
| 10 | 30,325 | 22,976 | -21,587 |
| 11 | 72,532 | -23,709 | 57,255 |
| 12 | 71,941 | 19,363 | 67,857 |
| 13 | 28,778 | 14,179 | -50,297 |
| 14 | 55,261 | -38,342 | 31,37 |
| 15 | 42,101 | 53,378 | 28,19 |
| 16 | 81,733 | 4,039 | 79,819 |
| 17 | 51,935 | 49,986 | -14,574 |
| 18 | 51,038 | -28,631 | -28,638 |
| 19 | 96,539 | -0,425 | 1,186 |
| 20 | 81,257 | -0,638 | -0,335 |
| 21 | 66,766 | -0,734 | -0,504 |
| 22 | 50,867 | -0,153 | -0,27 |
| 23 | 35,656 | -0,421 | -1,231 |
| 24 | 20,461 | -0,079 | -0,973 |
Tabella 1. L *, a *, b * valori per ogni patch del correttore colore (vedi Figura 1). La fonte di illuminazione è stato D50 e l'angolo di osservazione è stato 2 °.
Discussion
Valutazione high-throughput e accurata della morfologia delle piante d'organo e il colore è difficile a causa della sua natura quantitativa e quantificazione spesso soggettiva. TA fornisce misurazioni oggettive e precise di tratti di frutta diversi morfologiche e colorimetriche in modo high-throughput e semi-automatiche. L'utilità del TA è stato dimostrato in studi che hanno portato alla identificazione di forma pomodoro frutta QTL 2,4,5. Inoltre, la classificazione dei cultivars6 e la tassonomia di un gruppo di specie è stata valutata utilizzando l'uscita di AT 15,16. Alta espressione dei risultati frutto di pomodoro gene dom forma in 17 frutti allungati. Utilizzando la forma TA, delle foglie e cotiledone è stato determinato nelle linee che esprimono SUN per un elevato livello 7, dimostrando che l'applicazione può essere utilizzata efficacemente per misurare la morfologia degli organi della pianta anche altri. Inoltre, AT è stato di fondamentale importanza per identificare le basi genetiche della dimensione dei semi di pomodoro e semi di girasole 8,9. Infine, il modulo di prova colore implementato in TA è più preciso e accurato, e meno costoso rispetto ad altri metodi per analizzare il colore di frutta in pomodoro. In sintesi, TA è diventato uno strumento chiave per la valutazione oggettiva e affidabile della morfologia e la variazione di colore degli organi delle piante.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation (DBI 0227541).
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