Summary
इस प्रोटोकॉल या oocytes चूहों के oviduct से प्रारंभिक अवस्था निषेचित भ्रूण निकालने के लिए तकनीक दिखाता है. infindibulum पहचान करने और इसे में एक कुंद अंत सुई डालने की क्षमता सही ढंग से प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए आवश्यक है.
Abstract
तिथि करने के लिए, केवल कुछ अध्ययनों Peromyscus embryogenesis या प्रजनन जीव विज्ञान के सफल जोड़तोड़ की सूचना दी है. Peromyscus आनुवंशिक स्टॉक केंद्र (http://stkctr.biol.sc.edu) के साथ मिलकर, हम इस प्रणाली को विकसित करने की जरूरत प्रमुख मतभेद निस्र्पक हैं. एक प्राथमिक लक्ष्य oocyte / जल्दी भ्रूण पुनर्प्राप्ति का अनुकूलन करने के लिए किया गया है.
Protocol
भ्रूण / Oocyte पुनर्प्राप्ति
- भ्रूण / oocytes की पुनर्प्राप्ति से पहले कम से कम दो घंटे, KSOM 37 º सी सीओ 2 इनक्यूबेटर और FHM में रखा गया है -20 डिग्री से thawed होना चाहिए. एक गिलास पकवान युक्त तीन अवतल उथले कुओं KSOM के इन्क्यूबेटर में घर बूंदों के लिए प्रयोग किया जाता है. निर्जलीकरण को रोकने के लिए, KSOM और पकवान एक lidded कंटेनर कि तल पर पानी है में रखा जाता है. इस उपकरण में खनिज तेल के उपयोग के बिना वाष्पीकरण रोकता है.
- एक महिला ovulating से oviducts FHM के मीडिया में रखा जाता है. अभिविन्यास और एक अक्षुण्ण infindibulum सुनिश्चित करने के लिए, अंडाशय की एक छोटी अनुभाग के साथ गर्भाशय के oviduct और छोटे अनुभाग के साथ कट जाता है. एक कुंद 30 गेज सुई infindibulum में कुंद सुई डालने से oviduct से भ्रूण / oocytes निष्कासित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. infindibulum भ्रूण पुनः प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए है के बाद से oviduct टयूबिंग पारित करने के लिए एक सुई के लिए बहुत छोटा है. घटना में है कि infindibulum नष्ट कर दिया है, oviduct या तो हो खुले कटा चाहिए या भ्रूण बाहर निचोड़ा हुआ.
- भ्रूण oocytes / FHM के मीडिया में वसा बूँदों जो पेट्री डिश के नीचे डूब है पर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित करके पाया जाता है. भ्रूण / oocyte अलगाव 20x पर प्राप्त किया जा सकता है के रूप में इस उच्च वृद्धि से एक बड़ा देखने के क्षेत्र प्रदान करता है. भ्रूण / oocytes दौर वसा बूँदों कि इसके चारों ओर एक स्पष्ट अंगूठी की तरह लग रहे हो. मुँह pipetting, खींच केशिका गिलास का उपयोग करने के लिए ऊष्मायन और आगे हेरफेर के लिए KSOM भ्रूण oocytes / स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Oocyte पुनः प्राप्ति के लिए प्रक्रिया
तैयार
- FHM के पहले गला लें, और kSOM तैयार हैं.
- कुछ घंटे पहले, अंडा पुनर्प्राप्ति और टिप नीचे में पानी के साथ बॉक्स, सीओ 2 इनक्यूबेटर में जगह में कंटेनर जगह में जगह kSOM .
- प्रयोगशाला में पिंजरों लाओ और कटाई महिलाओं को मार.
- अंडाशय के कुछ और गर्भाशय के कुछ कटौती करने के लिए सुनिश्चित करें कि आप बंद oviduct का हिस्सा कटौती नहीं सावधान किया जा रहा oviduct कट.
- छोटे पेट्री डिश में FHM के मीडिया में रखें.
- एक जोड़े को और अधिक FHM के मीडिया पेट्री निस्तब्धता के लिए इस्तेमाल किया जा व्यंजन डालो.
Flushing
- एक निस्तब्धता (30 गेज कुंद) सुई सर्पिल अंत के साथ एक 1ml सुई से जुड़ा का उपयोग करें.
- एक बार और सुई का उपयोग पर एक oviduct लो, अंडाशय का हिस्सा छोड़ दिया संलग्न के पास पाया infundibulum में सम्मिलित हैं. यदि infundibulum और नष्ट नहीं किया जा सकता है, तो दो संदंश ले और oviduct के एक छोर पकड़. अन्य forcep के साथ, धीरे से एक टूथपेस्ट ट्यूब की तरह निचोड़, किसी भी भ्रूण बेदखल करना.
नोट: यह पेट्री डिश में एक गड़बड़ की एक बड़ी राशि बनाने के लिए, के रूप में ऊतक के एक बहुत इसके साथ आ जाएगा, ताकि आप बाद में एक अलग पेट्री डिश का उपयोग करना चाहते हो सकता है.
- भ्रूण देख, वसा टुकड़े पर खुर्दबीन ध्यान केंद्रित है और इसके चारों ओर स्पष्ट चक्र के साथ दौर "वसा टुकड़ा" के लिए देखो.
नोट: भ्रूण वसा के रूप में एक ही लग रही है, तो यह मुश्किल के लिए मिल सकता है . भ्रूण नीचे करने के लिए सिंक, तो वहाँ देखो.
- प्राप्तकर्ता महिलाओं की योनि स्मीयरों करो. इस स्तर पर, वे pseudopregnant होना चाहिए.
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Discussion
इस अनुच्छेद में, हम ovulation प्रेरित Peromyscus (superovulated) से oocytes की पुनर्प्राप्ति प्रदर्शित करता है. superovulation (के रूप में प्राकृतिक estrous चक्र विरोध) का उपयोग के कारण बहुत अधिक जिसके परिणामस्वरूप संख्या के लिए आम है. हालांकि, सावधानी ऐसे oocytes / भ्रूण का उपयोग, के रूप में दोनों हार्मोन ovulation और संवर्धन प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रभाव हो सकता है परिणामों की व्याख्या में लिया जाना चाहिए.
जब estrous पुष्टि की गई है, महिलाओं और euthenized oviducts अंडाशय के एक छोटे से हिस्से के साथ बरामद कर रहे हैं. अंडाशय के छोटे क्षेत्र infindibulum के स्थान के लिए एक मार्कर के रूप में प्रयोग किया जाता है. infindibulum अंडाशय के लिए बगल में बैठता है, बार बार ऊतकों की एक पतली परत के माध्यम से पेश. इस ऊतक के दूसरे पक्ष पर, oviduct के बाकी coiled है और अंत में योनि में जाता है. यह सबसे अच्छा है infindibulum के माध्यम से तरल पदार्थ को पुश करने के लिए oocytes निकालने. इस कारण एक तरह से अंतरफलक योनि - oviduct में स्थित वाल्व के लिए आवश्यक दिशा है. oocytes अगर वे पीछे वाल्व के माध्यम से पेश कर रहे हैं नुकसान हो सकता है.
एक 30 gaugle कुंद अंत सुई infindibulum में डाला जाता है. कुंद अंत सुई infindibulum खोलने फिट होगा, लेकिन oviduct टयूबिंग में फिट नहीं होगा. इसलिए, देखभाल करने के लिए सुनिश्चित करें infindibulum विच्छेदन या oocyte पुनः प्राप्ति के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं है लिया जाना चाहिए. अगर infindibulum क्षतिग्रस्त है, oviduct टयूबिंग संदंश के माध्यम से निचोड़ा हुआ जा सकता है किसी भी फंस oocytes बाहर निकलने के लिए अनुमति देते हैं.
मान लिया जाये कि महिला estrous में था, प्रजनन अंगों के एक लाल रक्त की आपूर्ति में वृद्धि की वजह से उपस्थिति है और सूजन दिखाई. हम ने कहा कि दो हिरण माउस प्रजातियों में मतभेद का परीक्षण किया: पी. polionotus पी. maniculatus से ज्यादा fattier अंडाशय और oviducts था, oocyte पुनः प्राप्ति और अधिक कठिन बना.
एक बार oocytes oviduct से निकाल दिया है, वे कम बढ़ाई पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जा सकता है. एक कम बढ़ाई पर oocytes देखना उपयोगकर्ता पेट्री डिश को स्कैन करने के लिए जल्दी की अनुमति देता है. खुर्दबीन वसा granules के नीचे की परत पर ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए. oocytes बाहर चारों ओर एक स्पष्ट की अंगूठी के साथ पूरी तरह गोल वसा granules की तरह दिखेगा. Oocytes का पता लगाने में सहायता करने के लिए, पेट्री डिश के माध्यम से पेश प्रकाश को समायोजित करने की कोशिश करें. इसके अलावा, अगर पेट्री डिश हल्के से हिल रहा है oocytes वसा बूँदों के लिए कदम नहीं तुलना. ये संकेत नौसिखिए शोधकर्ता मदद करने के लिए oocytes पता लगाने सकता है, तथापि, यह संभावना है कि कई परीक्षण आवश्यक होने से पहले एक प्रक्रिया के साथ सहज है.
पृथक oocytes स्टेम सेल लाइनों, chimeras के उत्पादन, या आनुवंशिक जोड़तोड़ के उत्पादन सहित प्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि हम मापदंडों और ovulation प्रेरित करने के लिए आवश्यक समय में काफी भिन्नता पाया है, पुनः प्राप्ति के लिए यह सामान्य तकनीकों कई कृंतक प्रजातियों (हिरण चूहों ~ 30 मिलियन साल दोनों प्रयोगशाला चूहों और चूहों से diverged) के लिए लागू किया जाना चाहिए. हम विशेष रूप से उम्मीद है कि इस उपन्यास सिस्टम है जहां इस तरह की तकनीक नहीं अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं में उन काम को फायदा होगा कर रहे हैं.
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Acknowledgments
मैं माइक डेवी Peromyscus आनुवंशिक स्टॉक केंद्र से उसकी मदद की, धैर्य और ज्ञान के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flushing needle | Tool | Zephyrtronics | ZT5-130-L | 30 G blunt |
| Forceps (2) | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Peromyscus | Animal | Peromyscus Genetic Stock Center | ||
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| FHM HEPES Buffered Media | Reagent | Specialty Media | MR-025-d | |
| KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL) | Reagent | Specialty Media | MR-020P-5F | |
| Mouth Pipette | Tool | Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing | ||
| Oocyte holding dish | Tool | Glass container with concave divets |
