Summary
Detta protokoll illustrerar tekniken för utvinning av ägg eller tidiga befruktade embryon från äggledare hos möss. Förmågan att identifiera infindibulum och sätt in en trubbiga änden nål i är det viktigt att korrekt hela proceduren.
Abstract
Hittills har endast ett fåtal studier som rapporterat framgångsrika manipulationer Peromyscus embryogenesen eller reproduktiva biologi. Tillsammans med Peromyscus Genetiska Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), vi är som kännetecknar de framträdande skillnader behövs för att utveckla detta system. Ett primärt mål har varit att optimera äggcellen / tidiga embryot hämtning.
Protocol
Embryot / Oocyte
- Minst två timmar före hämtning av embryon / ägg, är KSOM placeras i 37 º C CO 2 inkubator och FHM måste tinas från -20 °. En glasskål med tre konkav grunda brunnar används för att hysa droppar KSOM i inkubatorn. För att förhindra uttorkning, är KSOM och fat placeras i en lockförsedda behållare som har vatten i botten. Denna apparat förhindrar avdunstning utan användning av mineralolja.
- Den äggledarna från en ägglossning kvinnliga placeras i FHM medier. För att säkerställa orientering och en intakt infindibulum är en liten del av äggstocken skär tillsammans med äggledare och liten del av livmodern. Ett trubbigt 30 gauge nål används för att utvisa embryon / oocyter från äggledare genom att sätta in trubbiga nålen i infindibulum. Den infindibulum måste användas för att hämta embryon eftersom äggledare slangen är för liten för en nål att passera. I händelse av att infindibulum är förstört, måste äggledare vara antingen skivas öppen eller embryon trängs ut.
- Embryon / ägg finns i FHM medierna genom att fokusera mikroskop på fettet droppar som har sjunkit till botten av petriskål. Embryo / äggcell isolering kan uppnås vid 20x eftersom detta ger en större visningsyta än hög förstoring. Embryo / oocyter ser ut som runda fett droppar som har en tydlig ring runt den. Munpipettering, med hjälp av en drog glas kapillär, används för att flytta embryon / ägg till KSOM för inkubering och vidare manipulation.
Förfarande för Oocyte
Förberedelser
- Tina FHM och förbereda kSOM.
- Ett par timmar tidigare, placera kSOM i äggplockning behållare och lägg i spetsen låda med vatten i botten, placera i CO 2 inkubator.
- Ta burar till labbet och döda skörd honorna.
- Klipp ut äggledare var noga med att skära en del av äggstocken och en del av livmodern för att se till att du inte skära av en del av äggledare.
- Placera i FHM media i liten petriskål.
- Häll ett par mer FHM media petriskålar som ska användas för spolning.
Flushing
- Använd en spolning nål (30 gauge trubbig) ansluten till en 1 ml nål med spiral slut.
- Ta en äggledare i taget och med hjälp av nål, sätt in infundibulum hittades nära den del av äggstockarna lämnas kvar. Om infundibulum förstörs och inte kan användas, får ta två pincett och håll den ena änden av äggledare. Med andra forcep, kläm försiktigt, som en tandkrämstub, för att mata någon embryots.
OBS: Detta kommer att skapa en stor mängd av röran i petriskål, som en del av vävnad kommer med den, så du kanske vill använda en annan petriskål efteråt.
- För att se embryon, fokus mikroskop på fett bitar och leta efter runda "fett pjäs" med tydlig cirkel runt den.
Obs: embryon har samma utseende som fett, så det kan vara svårt att hitta. Embryona sjunker till botten, så titta där.
- Gör vaginala utstryk av mottagare honor. I detta skede bör de pseudopregnant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel visar vi att hämta ägg från ägglossning-inducerad (superovulated) Peromyscus. Användningen av superovulation (i motsats till naturliga estrous cykel) är vanlig på grund av den mycket större resulterande numren. Dock måste försiktighet iakttas vid tolkningen av resultaten använda sådana oocyter / embryon, eftersom både de hormoner som används för att framkalla ägglossning och odling kan ha effekter.
När estrous har bekräftats, är kvinnor euthenized och äggledarna återhämtade tillsammans med en liten del av äggstocken. Den lilla regionen äggstockarna används som en markör för placering infindibulum. Den infindibulum sitter bredvid äggstocken, ofta gånger skjuter genom ett tunt lager av vävnad. På andra sidan av denna vävnad, är resten av äggledare rullade och så småningom leder in i slidan. Det är bäst att pressa vätska genom infindibulum att extrahera oocyter. Denna riktning är nödvändigt på grund av en enkelriktad ventil placerad på slidan-äggledare gränssnitt. De oocyter kan skadas om de projiceras bakåt genom ventilen.
En 30-gaugle trubbiga änden nål sätts in i infindibulum. Den trubbiga änden Nålen kommer att passa infindibulum öppningen, men kommer inte passar in i äggledare slangen. Därför måste försiktighet iakttas för att säkerställa att infindibulum inte skadas under dissektion eller Oocyte. Om infindibulum är skadad, kan äggledare slangen pressas via pincett för att tillåta någon fångade ägg för att avsluta.
Förutsatt att honan var i estrous kommer reproduktionsorgan har en röd utseende på grund av ökad blodtillförsel och verkar svullet. Vi observerade skillnader i de två arter rådjur mus testade P. polionotus hade mycket fetare äggstockarna och äggledarna än P. maniculatus, vilket gör Oocyte svårare.
När ägg har avlägsnats från äggledare, kan de följas av ljusmikroskop vid låg förstoring. Visa oocyter till en lägre förstoringsgrad ger användaren möjlighet att skanna petriskål snabbt. Mikroskopet bör fokuseras på det nedersta lagret av fett granulat. De oocyter kommer att se ut helt rund fet granulat med en tydlig ring runt utsidan. Till hjälp att upptäcka de oocyter, försöka justera ljuset utstickande genom petriskål. Dessutom kommer om petriskålen är lätt skakas oocyter inte flytta jämfört med fett droppar. Dessa tips kan hjälpa nybörjare forskare att hitta ägg, dock är det troligt att flera försök kommer att krävas innan man är bekväm med förfarandet.
De isolerade oocyter kan användas i en mängd olika experiment inklusive framställning av stamcellslinjer, tillverkning av chimärer, eller genetiska manipulationer. Även om vi har hittat stora skillnader i de parametrar och den tidsplan som krävs för att inducera ovulation, bör den generella tekniker för hämtning tillämpas på många arter av gnagare (rådjur möss är ~ 30 miljoner år avvek från både laboratorie-möss och råttor). Vi är särskilt hoppfull om att detta kommer att gynna dem som arbetar i nya system där sådana metoder inte är väletablerade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Jag vill tacka Mike Dewey från Peromyscus genetiska Stock Centrum för hans hjälp, tålamod och kunskap.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Flushing needle | Tool | Zephyrtronics | ZT5-130-L | 30 G blunt |
| Forceps (2) | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5060 | |
| Peromyscus | Animal | Peromyscus Genetic Stock Center | ||
| Scissors | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| FHM HEPES Buffered Media | Reagent | Specialty Media | MR-025-d | |
| KSOM Embryo Culture Medium (5x 10 mL) | Reagent | Specialty Media | MR-020P-5F | |
| Mouth Pipette | Tool | Pulled from glass capillaries and attached to rubber tubing | ||
| Oocyte holding dish | Tool | Glass container with concave divets |
