Summary
Este vídeo demonstra o protocolo de um ensaio in vitro angiogênese que recapitula vários estágios de angiogênese. Lapso de tempo imagens de germinação, formação de lúmen, ramificação e anastomose - características-chave da angiogênese - são mostrados.
Abstract
A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, ramificação, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos dentro dos ensaios muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Baseado em trabalhos anteriores por Nehls e Drenckhahn, temos otimizado um ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese e, sobretudo, os vasos mostrar patente lumens intercelular cercado por CE polarizada. CE são revestidos em microcarregadores Cytodex e incorporados em um gel de fibrina. Os fibroblastos são camadas em cima do gel, onde eles fornecem necessárias fatores solúveis que promovem CE brotando da superfície das esferas. Depois de vários dias, numerosos vasos estão presentes que podem ser facilmente observado sob contraste de fase e microscopia de lapso de tempo. Este vídeo demonstra os passos-chave na criação dessas culturas.
Protocol
CÉLULAS PREPARAÇÃO
- Trazer HUVEC e fibroblastos em M199/10% FBS / Pen-Strep (1:100) 1-2 dias antes beading.
- Interruptor de médio a EGM-2 (CLONETICS) no dia anterior beading para HUVEC e no dia anterior a incorporação de fibroblastos.
- A concentração de ~ 400 HUVEC por talão é necessário.
- 20.000 fibroblastos por poço é necessário.
REVESTIMENTO as contas com HUVEC - -1 dia
- Trypsinize HUVEC.
- Permitir contas para resolver (Não centrifugar!). Aspirar o sobrenadante e lavar as contas brevemente em 1 mL de meio de EGM-2 quente.
- Mix contas 2500 w / 1X10 6 HUVEC em 1,5 mL de meio de EGM-2 quente em um tubo FACS. Colocá-lo na vertical na incubadora. (Isso será suficiente para ~ 10 poços. Scale up se necessário)
- Incubar por 4 horas a 37 ° C, agitando o tubo a cada 20 minutos. (Revestimento Bom é crucial para a brotação.)
- Após 4 horas, as contas de transferência para um balão revestido T25 em 5 mL de EGM-2 e deixar S / N.
Incorporação BEADS REVESTIDO EM GEL fibrina - DIA 0
- Preparar a solução de fibrinogênio 2,0 mg / mL (Ver secção receita).
- Adicionar 0,15 Unidades / mL de aprotinina para a solução de fibrinogênio.
- Transferência de contas revestida para um tubo cônico 15mL e deixe grânulos resolver. Contas ressuspender em 1 ml de EGM-2 e transferir para um tubo de centrifugação 1,5 ml.
- Lave as contas 3X com 1mL de EGM-2 por pipetagem para cima e para baixo lentamente.
- Contagem de contas em uma lamela e ressuspender em solução de fibrinogênio em uma concentração de aproximadamente 500 contas / mL.
- Adicionar 0,625 Unidades / mL de trombina em cada poço.
- Adicionar 0,5 mL da suspensão de fibrinogênio / talão para cada poço de uma placa de 24 poços.
Alterar a ponta da pipeta para cada poço! - Misture a trombina eo fibrinogênio por subir e descer suavemente com a ponta da pipeta ~ 4-5 vezes. Tenha cuidado para não fazer bolhas grandes.
- Deixar a placa por 5 min na capa, em seguida, colocá-lo na 37 ° C-incubadora por 10-15 min para gerar um coágulo.
- Enquanto espera para o coágulo, trypsinize fibroblastos.
- Adicionar 1 mL da EGM-2 por poço queda sábio.
- Fibroblastos de sementes em cima de fibrina gel em uma concentração de 20.000 células por poço.
NOTAS:
Normalmente, quando o gel de fibrina é formada, você verá pequenas bolhas no gel. Não se preocupe, eles vão desaparecer em 3-4 dias.
Troque a mídia todos os dias, ou seja, Dia 2, 4, 6, etc ..
De dia 3 ou 4, você deve começar a ver a germinação.
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Discussion
Há um consenso crescente de que em três dimensões (3D) em ensaios de angiogênese in vitro oferecer um modelo que é muito mais próximo do ambiente real in vivo do que pode ser conseguido usando culturas 2D. É evidente que sistemas 3D superiores deve ser reprodutível, e ser capaz de imitar vários dos principais passos da angiogênese. Apesar de vários ensaios anteriores 3D têm sido desenvolvidos, muitos destes usar difíceis de obter células microvascular, ou apenas recapitular algumas das etapas. Neste vídeo, descrevemos e realizar um ensaio in vitro otimizado angiogênese que utiliza veia umbilical humano CE, que são facilmente obtidos e da CE mais comumente usados em pesquisas vascular. O ensaio, ao longo de vários dias, de forma consistente reproduz embarcações de comprimento com clara, patente lumens intercelular cercado por CE polarizada. Estágios posteriores da CE ramificação e fusão de navios (anastomose) também são observados. Importante, nestas culturas a HUVEC submeter todas as mudanças morfológicas que são vistos com microvascular CE, seja in vivo ou in vitro, incluindo brotando, alinhamento de migração, a proliferação de formação do tubo, ramificação e anastomose. O perfil de expressão gênica das mudanças HUVEC, em paralelo, para que mais se aproximam de microvascular CE. Em conclusão, apresentamos um protocolo otimizado para um modelo in vitro angiogênese que recapitula várias etapas importantes deste processo.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytodex-3 Beads | Reagent | Amersham | 17-0485-01 | 10 g/bottle. 1.0.5 g of dry beads are hydrated and swollen in 50 mL PBS (pH = 7.4) for at least 3 h at RT. Use a 50 mL tube and place it on the rocker.2.Let the beads settle down (~ 15 min). Discard the supernatant and wash the beads for a few minutes in fresh PBS (50 mL).3.Discard the PBS and replace with fresh PBS:25 mL -> 20 mg/mL => 60000 beads/mL or 50 mL -> 10 mg/mL => 30,000 beads/ mL4.Place the bead suspension in a siliconized glass bottle (Windshield Wiper or Sigmacote).5.Sterilize the beads by autoclaving for 15 min at 115°C.6.Store it at 4°C. |
| Aprotinin | Reagent | Sigma-Aldrich | A-1153 | 10 mg/bottle. Reconstitute lyophilized aprotinin at 4 U/mL in DI water. Sterile filter. Make aliquots of 1 mL each. Store at -20 °C. |
| Fibrinogen Type I | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8630 | 1 g. Dissolve 2 mg/mL fibrinogen in DPBSNote clottable protein % and adjust accordingly Heat in a 37 °C-water bath to dissolve the fibrinogen. Mix by inverting the tube. Do not vortex.Sterile filter through 0.22 um |
| Thrombin | Reagent | Sigma-Aldrich | T-3399 | 22 mg = 1,000 units. Reconstitute in sterile water at 50 U/mL. Make aliquots of 0.5 mL each. Store at -20 °C. |
References
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A microcarrier-based cocultivation system for the investigation of factors and cells involved in angiogenesis in three-dimensional fibrin matrices in vitro. Histochem Cell Biol. 104, 459-466 (1995).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50, 311-322 (1995).
