Ein Modell des Disturbed Flow-Atherosklerose in Maus Halsschlagader durch partielle Ligation und eine einfache Methode zur RNA-Isolierung aus Carotid Endothelium

Summary

Dies beschreibt eine partielle carotis Ligation Chirurgie, die gestörte Strömungsverhältnisse und die anschließende Atherosklerose-Entwicklung (in zwei Wochen) führt mit intraplaque neo-Vaskularisation (in vier Wochen) in der Maus Arteria carotis communis. Wir beschreiben eine neuartige Methode der RNA-Isolierung aus der Intima, das hohe Reinheit endothelial RNA.

Abstract

Trotz der bekannten engen Verbindung, hat einen direkten Beweis, der gestörten zur Atherogenese gefehlt. Vor kurzem haben wir eine modifizierte Version der Carotis partielle Ligation verwendeten Methoden [1,2] zeigen, dass es akut induziert niedrig und oszillatorische Strömungsverhältnisse, zwei wichtige Eigenschaften des gestörten, in der Maus Arteria carotis communis. Mit diesem Modell haben wir direkten Beweis dafür, dass gestörten Tat führt zu einer schnellen und robusten Atherosklerose Entwicklung in Apolipoprotein E-Knockout-Maus [3] zur Verfügung gestellt. Wir haben auch eine Methode entwickelt, von Endothel-RNA-Präparation mit hoher Reinheit aus dem Maus-Intima [3]. Mit dieser Maus-Modell und Methode fanden wir, dass partielle Ligation Ursachen endotheliale Dysfunktion in einer Woche, gefolgt von robusten und schnellen Atherombildung in zwei Wochen in einem hyperlipämischen Mausmodell mit Features von komplexen Läsionen Bildung wie intraplaque Neovaskularisation von vier Wochen. Diese schnelle

Protocol

1. Teilweise Unterbindung der linken Arteria carotis

1. Mäuse sind bei ~ Alter von 8 Wochen verwendet. Das Gewicht der Mäuse wird empfohlen, mindestens 18 Gramm betragen.
2. Sterilisieren der Instrumente für 30 Sekunden in bead Instrument Sterilisator und abkühlen lassen
3. Induce Anästhesie mit Ketamin (80mg/kg) und Xylazin (10mg/kg) intraperitoneal (ip) Injektion oder alternative Anästhesie durch IACUC genehmigt. Für ip-Injektion, injizieren Maus in der linken niedrigen Quadranten des Bauches.
4. Bewegen Sie die Maus in einer Wärmekammer, bis sie vollständig betäubt. Stellen Sie sicher, Narkosetiefe mit Reaktion bis zu den Zehen kneifen.
5. Bewegen Sie die Maus auf einer chirurgischen Stadium, in Rückenlage (Bauch nach oben) stellen. Kleben Sie die Vorderpfoten Handflächen nach oben und die Hinterpfoten allein auf der Bühne.
6. Bewerben liberal Menge Enthaarungsmittel (zB Nair), um den Hals zwischen dem Unterkiefer und dem Brustbein. Massieren Sie, bis alle Haare entfernt.
7. Reinigen Sie das Enthaarungsmittel und gelten großzügige Menge von Betadine zu enthaarten Bereich.
8. Bereiten Sie 1 Zoll lange Abschnitte 6:0-Seidennaht für Ligationen. Jede Maus benötigen Sie zwei Stück der Naht.
9. Mit einem scharfen kleinen Schere, einen 4-6mm vertikalen Schnitt in der Mitte des Halses. Sowohl die Haut und das darunterliegende Faszie müssen geschnitten werden.
10. Bewegen Sie den linken Ohrspeicheldrüse von der Mittellinie nach links und beginnen unverblümt Sezieren nur rechts von der Luftröhre. Sie sollten in der Lage, die pulsierende linke A. carotis leicht zu identifizieren.
11. Folgen Sie der Carotis kaudal bis zur Bifurkation zu finden.
12. Unverblümt sezieren der Bifurkation, die folgenden vier distalen zweigt die linke Arteria carotis communis freizulegen: Arteria carotis externa, Arteria carotis interna, A. occipitalis und A. thyreoidea superior. Diese Schiffe, vor allem überlegen Schilddrüse, kann brüchig. Seien Sie sehr vorsichtig mit Ihrem Dissektion.
13. Vernähen der A. carotis externa über dem oberen Schilddrüse mit 6-0 Seidenfaden. Um dies zu tun, Erster Durchlauf Pinzette unterhalb der Arterie und schnappen Sie sich einen Stück vorgeschnittenen Fäden mit Hilfe von Ihren anderen Pinzette. Ziehen Sie die Naht bis unter die Arterie passieren. Tie fest Vermeidung jeglicher umgebenden Gewebe in den Knoten gefangen. Wenn Sie binden unter dem Abheben des Arteria thyreoidea superior, durch das Ende der Prozedur, die Sie effektiv eine komplette Ligatur, die eine wesentlich andere Modell ist durchgeführt haben.
14. Vernähen der A. carotis interna und occipital Arterien mit einem Knoten mit der gleichen Technik.
15. Stellen Sie sicher, Position der Nähte und die Durchgängigkeit der Arteria thyreoidea superior.
16. Ungefähre der Haut und in der Nähe der Haut mit einem kleinen Betrag von Tissue-Mend.
17. Legen Mäuse in einer Wärmekammer bis zur Genesung. Wiederherstellung dauert in der Regel 30 bis 60 Minuten.
18. Eine einzelne Dosis von Buprenorphin (0.1mg/kg) sollten sofort verabreicht werden nach der Operation, wenn die Anästhesie nicht zur Verfügung stellt längerer Schmerzlinderung (zB inhaliert Isofluran) oder wenn das Tier in Not ist innerhalb der ersten 24 Stunden. Nach unserer Erfahrung bietet die Ketamin-Dosis für die Anästhesie verabreicht ausreichende Analgesie bei Operationen durch erfahrene Chirurgen durchgeführt wird und keine weitere Analgesie erforderlich ist.

2. Karotis-Ultraschall-Untersuchung

1. Zur Validierung, ob die teilweise Ligation induzierten Fluss gestört, sollte carotis flow untersucht 1 Tag post-Ligation
2. Induce Narkose mit Isofluran - Narkoseeinleitung Box könnte bei Bedarf verwendet werden
3. Legen Sie narkotisierten Mäusen auf die Bildgebung der Bühne, Bauch nach oben
4. Band Arme und Beine, um EKG-Sensor in der Bildgebung der Bühne
5. Entlauben Hals durch liberale Anwendung von Nair (dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn nicht bereits für die Ligation Verfahren erledigt)
6. Legen rektale Thermometer Temperatur aufzeichnen
7. Bewerben Echo-Gel auf den Hals
8. Start in B-Modus.
9. Imaging Flugzeug sollte 90 Grad (Knopf an der Sonde sollte nach der Nase der Maus Punkt)
10. Lower-Sonde auf Maus Hals, bis das Bild entsteht.
11. Manipulieren der Bühne links und rechts, bis Luftröhre (Mitte-line-Struktur) identifiziert
12. Identifizieren linken Arteria carotis communis
13. Tilt Bildgebung Bühne, so dass ein Winkel zwischen Bildebene und der Carotis erstellt. Je größer dieser Winkel ist, desto stärker ist das Doppler-Signal werden.
14. Legen PW-Doppler in der Mitte der linken Arteria carotis.
15. Verwenden Sie Winkelkorrektur nach Bedarf.
16. Wiederholen Sie die Messungen auf der rechten Arteria carotis.
17. Erfolgreiche partielle carotis Ligation wird in Gesamtreduktion in flow (~ 80-90%) in die linke A. carotis im Vergleich mit der rechten Seite durch, mit Umkehrung der Strömung in Richtung Aorta Einlass während der Diastole.
18. Sobald zufriedenstellende Bilder erhalten worden sind, schalten Sie Anästhesie, wischen echo off Gel Mäusen und Mäusen frei vom Band restraints. Legen Mäuse in erwärmt Erholung Kammer.

3. Intima RNA-Isolierung aus A. carotis

1. Sacrifice Mäuse durch CO _2-Inhalation nach den institutionellen IACUC Protokoll
2. Kleben Sie die Pfoten auf einem Papiertuch.
3. Schneiden Sie die Haut der Maus aus dem Bauch nach oben des Thorax.
4. Öffnen der Bauchdecke unterhalb des Brustkorbs mit einer scharfen Schere.
5. Heben Sie das Brustbein mit einer Pinzette und schneiden das Zwerchfell, dann schneiden Sie den Brustkorb in das Herz aussetzen.
6. Schneiden Sie die Hohlvene mit einer Schere.
7. Pressure perfuse (120 mmHg) für 2 bis 3 min mit physiologischer Kochsalzlösung mit 10 Einheiten / mL Heparin durch den linken Ventrikel, bis die Lunge und Leber blass geworden.
8. Schneiden Sie die Haut des Halses und entfernen Sie alle Fett, Muskeln und Bindegewebe, bis die Halsschlagadern ausgesetzt sind.
9. Legen Sie die Maus unter einem Binokular.
10. Punktion ein Loch rechts unterhalb der Ligatur Standorten in der linken Halsschlagader zum zweiten Perfusion.
11. Pressure perfuse wieder für ~ 1 min mit physiologischer Kochsalzlösung mit 10 Einheiten / mL Heparin durch den linken Ventrikel, so dass die linke Halsschlagader gut durchgelesen.
12. Mit einer feinen Spitze Pinzette und kleine Feder Schere, vorsichtig den peri-adventitielle Gewebe um die Karotiden. Achten Sie darauf, nicht zu quetschen oder dehnen Sie die Carotiden in dieser Reinigungsstufe.
13. Schneiden Sie die linke Halsschlagader zwischen dem Aortenbogen und die Ligation-Punkten über dem Karotisgabel.
14. Schneiden Sie die rechte Halsschlagader zwischen der rechten A. subclavia Verzweigung und der Carotis-Bifurkation.
15. Übertragen Sie die Karotiden zu einer 35 mm Kulturschale mit eiskaltem HBSS. Wenn nötig, vorsichtig entfernen Sie alle verbleibenden peri-adventitielle Gewebe.
16. Bereiten Sie eine Insulin-Spritze (10.3 ml Spritze) mit einer 29g Nadel durch die Befüllung mit 150 pl QIAsol Lysepuffer (Qiagen) pro Halsschlagader.
17. Vorsichtig Spitze der Nadel in das eine Ende der Halsschlagader.
18. Halten Sie die Halsschlagader und die Spitze der Nadel mit einer Zange, schnell (~ 1 sec) spülen QIAsol Lysepuffer (150 ul) in ein 1,5 ml Röhrchen (Intima Eluat).
19. Spülen Sie die Carotis übrig (media + Adventitia) einmal in HBSS, steckte es in ein 1,5 ml-Tube und Snap-in flüssigem Stickstoff einfrieren.
20. Intima Eluat und die gefrorenen Reste werden dann für Intima oder Media + Adventitia RNA-Isolierung mit dem miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Wir teilweise ligiert Maus nach links Halsschlagadern und Ultraschall-Untersuchung erfolgte 1 Tag nach dem Eingriff durchgeführt. Wie in Abbildung 1 dargestellt, reduziert erfolgreiche partielle Ligation Blutflussgeschwindigkeit und kehrt flow (gestörten) in der linken Arteria carotis communis während der Diastole. Teilweise Ligation von ApoE knockout (KO) Mäusen durch eine fettreiche Ernährung begleitet induziert robust Atherosklerose in der linken Arteria carotis communis (LCA), aber nicht in der kontralateralen rechten Carotis, um zwei Wochen (Abbildung 2). RNA aus der Intima gesammelt enthält endothelial Markergene wie PECAM-1, während frei von medialen glatten Muskelzellen Markergene wie a-SMA (Abbildung 3).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der A. carotis Anatomie und Ligationen: Drei Äste der linken Arteria carotis communis (LCA) [A. carotis externa (ECA), A. carotis interna (ICA), und A. occipitalis (OA)] wurden ligiert, während die Arteria thyreoidea superior (STA) zu öffnen.

Abbildung 2: Die Ultraschall-Bilder zeigen Strömungsgeschwindigkeit Profile und zeigen, dass partielle Ligation Strömungsumkehr (durch Pfeile angedeutet) induziert in LCA während der Diastole. Flow in RCA bleibt unverändert nach der Ligation.

Abbildung 3: Partielle Ligation und fettreichen Diät schnell eine Arteriosklerose in LCA von ApoE KO-Mäusen ApoE KO-Mäuse wurden teilweise unterbunden und fütterte die fettreiche Ernährung für 1 bis 3 Wochen.. Gefrierschnitte von LCA wurden mit Oil-Red-O gefärbt.

Abbildung 4. Methode der Intima-RNA-Präparation. Intima RNA und medialen + Adventitia (m + a) RNA wurden aus scheinoperierten RCA und LCA in C57BL / 6 Mäusen erhalten. RNAs wurden durch semi-quantitative RT-PCR (A) und qPCR (B, C) ​​für PECAM-1 und α-SMA mit 18 Jahren als interne Kontrolle analysiert. Balkendiagramme sind Mittelwert ± SEM, n = 3.

Discussion

In diesem Verfahren wird eine ordnungsgemäße Identifizierung aller Zweige der A. carotis einschließlich der A. carotis externa, A. carotis interna, A. occipitalis und A. thyreoidea superior unerlässlich. Es ist auch wichtig, um das Strömungsbild mit Hilfe von Ultraschall als bewiesen zu überprüfen. In unserem erfahrenen Händen ist unser Erfolg von Teil-Ligation Operationen auf dem Ultraschall-Untersuchungen von mehr als 500 Mäusen besser als 90%. Für die Karotis-Intima-RNA-Präparationen, ist es wichtig, die Aufmerksamkeit auf das Erscheinungsbild der Carotis nach der ersten Perfusion Schritt zu zahlen. Bei Anzeichen von flow Blockade in der linken Arteria carotis an dieser Stelle empfehlen wir nicht mit diesen Proben zur weiteren Analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter Internationl Inc.	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)	Qiagen	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System	VisualSonics, inc.	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile	Covidien	s-1172 c2
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	or similar
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946