Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

Summary

Esta descreve uma cirurgia de ligadura parcial da carótida, o que causa as condições de fluxo perturbado e desenvolvimento da aterosclerose subsequente (em duas semanas) com intraplaca neo-vascularização (em quatro semanas) em ratos artéria carótida comum. Descrevemos também um novo método de isolamento de RNA a íntima carótida, proporcionando RNA de alta pureza endoteliais.

Abstract

Apesar da conhecida associação perto, evidências diretas ligando fluxo perturbado a aterogênese tem faltado. Recentemente, usou uma versão modificada do carótida métodos de ligadura parcial [1,2] para mostrar que induz agudamente condições de baixo fluxo e oscilatório, duas características-chave do fluxo perturbado, no rato artéria carótida comum. Usando esse modelo, nós fornecemos evidências diretas de que o fluxo perturbado realmente leva ao desenvolvimento de aterosclerose rápido e robusto em apolipoproteína rato knockout E [3]. Também desenvolveu um método de preparação de RNA endotelial com elevado grau de pureza da carótida íntima do mouse [3]. Usando este modelo de mouse e método, encontramos que a ligadura parcial causa disfunção endotelial em uma semana, seguido pela formação de ateromas robusta e rápida em duas semanas em um modelo de camundongo hiperlipidêmicos, juntamente com recursos de formação de lesão complexa como a neovascularização intraplaca por quatro semanas. Essa rápida

Protocol

1. Ligadura parcial da artéria carótida esquerda

1. Mouses são utilizados em ~ 8 semanas de idade. O peso dos ratos é recomendado para ser pelo menos 18 gramas.
2. Esterilizar os instrumentos para 30 segundo no esterilizador instrumento talão e deixe esfriar
3. Induzir a anestesia com Ketamina (80mg/kg) e xilazina (10mg/kg) intraperitonial injeção (ip) ou alternativa anestesia aprovado pelo IACUC. Para injeção ip, injetar mouse no quadrante esquerdo baixo do abdômen.
4. Colocar o mouse em uma câmara de aquecimento até que esteja completamente anestesiado. Verifique a profundidade da anestesia com resposta a pitada dedo do pé.
5. Colocar o mouse em um estágio cirúrgico, em decúbito dorsal (barriga para cima lado) posição. Tape as patas fore-palmas para cima e na sola patas traseiras, até o palco.
6. Aplique uma quantidade liberal de agente depilatório (por exemplo, Nair) no pescoço entre a mandíbula eo esterno. Massageie suavemente até que todo o cabelo é removido.
7. Limpe o agente depilatórios e aplicar quantidade generosa de Betadine para a área depilada.
8. Prepare uma polegada de comprimento seções de 6-0 seda para ligadura. Cada rato vai precisar de dois pedaços de sutura.
9. Usando uma tesoura afiada pequena, faça uma incisão 4-6mm vertical no meio do pescoço. A pele e da fáscia subjacente precisam ser cortadas.
10. Mover a parótida esquerda da linha média para a esquerda e começar a dissecar sem rodeios logo à direita da traquéia. Você deve ser capaz de identificar a carótida esquerda pulsante comum facilmente.
11. Siga as carótida comum caudalmente até localizar a bifurcação.
12. Sem rodeios dissecar a bifurcação para expor os seguintes quatro ramos distais a artéria carótida comum esquerda: artéria carótida externa, artéria carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior. Estas embarcações, de tireóide, especialmente superior, pode ser frágil. Tenha muito cuidado com o seu esvaziamento.
13. Empate fora da carótida externa ACIMA superior da tireóide 6-0 fio de seda. Para fazer isso, passe um fórceps debaixo da artéria e pegar um pedaço de sutura precut com a ajuda do seu fórceps outros. Puxe o fio para passar debaixo da artéria. Amarre firmemente evitando qualquer tecido circundante ser pego no nó. Se você amarrar abaixo da decolagem da artéria tireoidiana superior, até o final do procedimento você vai efetivamente ter realizado uma ligadura completa que é um modelo substancialmente diferente.
14. Amarrar as artérias carótida interna e occipital, com um nó usando a mesma técnica.
15. Verificar a posição de suturas e patência da artéria tireóidea superior.
16. A pele ea pele aproximada perto usando uma pequena quantidade de tecido-Mend.
17. Camundongos lugar em uma câmara de aquecimento até a recuperação. Recuperação normalmente leva 30 a 60 minutos.
18. Uma única dose de buprenorfina (0.1mg/Kg) deve ser administrado imediatamente após a cirurgia, se a anestesia utilizada não proporcionar alívio da dor prolongada (ou seja, isoflurano inalado) ou se o animal está em perigo nas primeiras 24 horas. Em nossa experiência, a dose de quetamina administrada para anestesia fornece analgesia suficiente quando a cirurgia é realizada por cirurgião experiente e sem analgesia adicional é necessária.

2. Carótida exame ultra-sonográfico

1. Para validar se a ligadura parcial induzida perturbado fluxo, fluxo carotídeo devem ser examinados um dia pós-ligadura
2. Induzir a anestesia com isoflurano - caixa de indução da anestesia pode ser usada, se necessário
3. Coloque os ratos anestesiados no palco de imagem, lado de barriga para cima
4. Tape braços e pernas para ECG sensor de imagem no palco
5. Desfolhar pescoço pela aplicação liberal de Nair (esta etapa só é necessária se não tiver feito para o procedimento ligadura)
6. Insira o termômetro retal para registro de temperatura
7. Aplique gel eco no pescoço
8. Iniciar em modo-B.
9. Plano de imagem deve ser de 90 graus (botão na sonda deve apontar para o nariz do mouse)
10. Menor sonda para o pescoço do mouse até a imagem é obtida.
11. Manipular estágio esquerda e direita até traquéia (mid-line estrutura) é identificado
12. Identificar artéria carótida comum esquerda
13. Estágio de imagem inclinação, para que um ângulo é criado entre o plano de imagem e da carótida. Quanto maior o ângulo isso, o forte é o sinal Doppler será.
14. Lugar onda de pulso Doppler no meio da carótida comum esquerda.
15. Use correção do ângulo, conforme necessário.
16. Repetir as medições sobre a carótida comum direita.
17. Ligadura parcial da carótida sucesso resultará em redução global no fluxo (~ 80-90%) na carótida comum esquerda em comparação com o lado direito, com reversão do fluxo de entrada para a aorta durante a diástole.
18. Uma vez que as imagens foram satisfatórios obtidos, desligue a anestesia, limpe echo off gel ratos e camundongos livre de res fitatraints. Coloque os ratos na câmara de recuperação aquecido.

3. Isolamento de RNA íntima carótida

1. Sacrifício camundongos por inalação de CO ₂ de acordo com o protocolo institucional IACUC
2. Tape as patas a uma toalha de papel.
3. Cortar a pele do rato do abdômen para o topo do tórax.
4. Abrir a parede abdominal abaixo da caixa torácica com uma tesoura afiada.
5. Levantar o esterno com uma pinça e corte o diafragma e, em seguida cortar as costelas para expor o coração.
6. Cortar a veia cava com uma tesoura.
7. Perfundir pressão (120 mmHg) por 2 a 3 min com solução salina contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo até os pulmões e fígado tornar-se pálida.
8. Cortar a pele do pescoço e remover toda a gordura, músculos e tecidos conectivos até as artérias carótidas são expostos.
9. Posicione o mouse em um microscópio de dissecação.
10. Punção um furo logo abaixo os sites ligadura na carótida esquerda para a segunda perfusão.
11. Perfundir pressão novamente para min ~ 1 com soro fisiológico contendo 10 Unidades / mL de heparina através do ventrículo esquerdo, certificando-se a carótida esquerda é bem perused.
12. Usando uma pinça de ponta fina e uma tesoura pequena mola, remova cuidadosamente os tecidos peri-adventícia ao redor das carótidas. Tenha cuidado para não espremer ou esticar a carótidas durante esta etapa de limpeza.
13. Cortar a artéria carótida esquerda entre o arco aórtico e os pontos de ligação acima da bifurcação da carótida.
14. Cortar a artéria carótida direita entre o ponto de ramificação da artéria subclávia direita e na bifurcação da carótida.
15. Transferência das carótidas a um prato 35 milímetros cultura, contendo gelada HBSS. Se necessário, remova cuidadosamente qualquer tecido peri-adventícia restantes.
16. Prepare uma seringa de insulina (3 / seringa de 10 ml) com uma agulha de 29G, preencha com 150 mL de buffer QIAsol lise (Qiagen) por cada carótida.
17. Insira cuidadosamente a ponta da agulha em uma das extremidades da carótida.
18. Enquanto mantém a carótida ea ponta da agulha com uma pinça, rapidamente (~ 1 seg) liberar o buffer de lise QIAsol (150 mL) em um tubo de 1,5 ml (eluato íntima).
19. Lavar o restante da carótida (media + adventícia) de vez em HBSS, colocá-lo em um tubo de 1,5 ml, e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido.
20. Intima eluato e os restos congelados são então utilizados para o isolamento + íntima ou mídia RNA adventícia usando o mini-kit miRNeasy (QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante.

4. Resultados representativos:

Nós parcialmente ligada esquerdo do mouse artérias carótidas e ultra-sonografia foi realizada um dia após o procedimento. Conforme mostrado na Figura 1, ligadura parcial sucesso reduz a velocidade do fluxo sanguíneo e inverte o fluxo (fluxo perturbado) na artéria carótida comum esquerda durante a diástole. Ligadura parcial da ApoE knockout (KO) ratos acompanhados por uma dieta rica em gordura induz a aterosclerose robusta na artéria carótida comum esquerda (LCA), mas não na carótida direita contralateral, por duas semanas (Figura 2). RNA coletados a partir da íntima carótida contém genes marcadores endoteliais como PECAM-1, enquanto livre de medial do músculo liso genes de células marcador como um SMA (Figura 3).

Figura 1: Esquema da anatomia carótida e ligadura: Três ramos da artéria carótida comum esquerda (LCA) [artéria carótida externa (ACE), artéria carótida interna (ACI) e artéria occipital (OA)] foram ligados, deixando a artéria tireóidea superior (STA) aberto.

Figura 2: As imagens de ultra-som mostram perfis de velocidade de fluxo e revelam que a ligadura parcial induz inversão de fluxo (indicado por setas) na LCA durante a diástole. Fluxo em RCA permanece inalterado após a ligadura.

Figura 3: ligadura parcial e alto teor de gordura da dieta rapidamente induz aterosclerose em camundongos ApoE LCA de camundongos ApoE KO KO foram parcialmente ligada e alimentados com a dieta rica em gordura para 1-3 semanas.. Cortes congelados de LCA foram coradas com Oil Red-O-.

Figura 4. Método de preparação RNA íntima. RNA íntima e média + adventícia (m + a) RNA foram obtidos a partir sham-operado RCA e LCA em camundongos C57BL / 6. RNAs foram analisados ​​por semi-quantitativa de RT-PCR (A) e qPCR (B, C) ​​para PECAM-1 e α-SMA utilizando 18 anos como um controle interno. Gráficos de barras são média ± EPM, n = 3.

Discussion

Neste procedimento, a identificação adequada de todos os ramos da carótida comum, incluindo a carótida externa, carótida interna, artéria occipital e da artéria tireóidea superior é essencial. Também é importante verificar o padrão de fluxo com ultra-som, como demonstrado. Em nossas mãos experientes, nossa taxa de sucesso de cirurgias ligadura parcial com base nos estudos de ultra-som de mais de 500 ratos é melhor do que 90%. Para a carótida preparações íntima RNA, é importante prestar atenção à aparência da carótida após a etapa de perfusão em primeiro lugar. Se houver evidência de bloqueio de fluxo na carótida comum esquerda, neste momento, nós não recomendamos usar essas amostras para análise posterior.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)	Baxter Internationl Inc.	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)	Tyco Healthcare, Covidien	8881600145
HBSS	Cellgro	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)	Qiagen	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System	VisualSonics, inc.	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile	Covidien	s-1172 c2
Small scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5005	or similar
Tissue Mend II	Webster Veterinary	07-856-7946