Summary
이것은 일반적인 마우스 경동맥의 intraplaque 네오 - vascularization (4 주)와 방해 흐름 조건 및 후속 죽상 경화증 개발 (2 주) 원인 부분 경동맥 내고 수술을 설명합니다. 우리는 또한 고순도 내피 RNA를 제공하고, 경동맥 intima에서 RNA의 분리의 소설 방법을 설명합니다.
Abstract
잘 알려진 가까운 협회에도 불구하고, atherogenesis에 방해 흐름을 연결하는 직접적인 증거가 부족했습니다. 우리는 최근 경동맥 부분 결합 방식의 수정된 버전을 사용해야 [1,2]는 심하게 마우스 일반적으로 경동맥의 낮은 oscillatory 흐름 조건 방해 흐름의 두 주요 특성을 유도 것을 보여주기 위해. 이 모델을 사용, 우리는 방해 흐름이 실제로 Apolipoprotein E의 녹아웃 마우스에서 신속하고 강력한 죽상 경화증의 개발 [3] 단서가 확실한 증거를 제공하고 있습니다. 우리는 또한 마우스 경동맥 intima [3]에서 고순도로 내피 RNA 준비하는 방법을 개발했습니다. 이 마우스 모델과 방법을 사용하여, 우리는 그 부분 내고는 사주에 의해 그러한 intraplaque neovascularization 같은 복잡한 병변 형성의 기능과 함께 hyperlipidemic 마우스 모델에서 2 주내에 강력하고 빠른 atheroma의 형성에 의해 다음, 일주일에 내피 기능 장애의 원인이 발견했습니다. 이 급속한
Protocol
1. 왼쪽 경동맥 부분 내고
- 생쥐는 세 ~ 8 주가되면 사용됩니다. 생쥐의 무게는 최소한 18g으로 권장합니다.
- 비드 악기 살균기 30 초 악기를 소독하고 진정 수
- 케타민을 (80mg/kg)과 Xylazine (10mg/kg) IACUC 승인으로 intraperitoneal (IP) 주입 또는 대체 마취와 마취를 유발. IP 주사, 복부의 왼쪽 낮은 사분면에 마우스를 주입.
- 완전히 anesthetized까지 온난 챔버에 넣어 마우스. 발가락 핀치에 대한 응답과 마취의 깊이를 확인합니다.
- 부정사 (배꼽 사이드까지) 위치에 수술 무대에서 플레이스 마우스. 테이프 포어 - 포스 야자수와 무대 아래로 뒷다리 - 싶단다 단독.
- mandible과 흉골 사이에 목에 depilatory 에이전트 교양 금액 (예 : 나이르)을 적용합니다. 부드럽게 마사지는 모든 머리가 제거됩니다 때까지.
- depilatory 에이전트를 청소하고 depilated 지역 Betadine의 자유 금액을 적용합니다.
- ligations에 대한 6-0 실크 봉합사의 1 인치 길이의 섹션을 준비합니다. 각 마우스 치료의 두 가지가 필요합니다.
- 날카로운 작은 가위를 사용하여 목 가운데 4-6밀리미터 수직 절개를합니다. 피부와 기본 근막 모두 절단해야합니다.
- 정중선에서 왼쪽으로 왼쪽 귀 부근의 선 (腺)을 이동하고 퉁명스럽게 바로 기관의 해부 시작합니다. 당신은 쉽게 pulsating 왼쪽 일반 경동맥을 식별할 수 있어야합니다.
- 당신이 분기점을 찾을 때까지 caudally 일반적인 경동맥을 따르십시오.
- 외부 경동맥의 동맥, 내부 경동맥, 후두 동맥과 우수한 갑상선 동맥 : 퉁명스럽게 왼쪽 일반적인 경동맥에서 다음 네 가지 말초 지점을 노출하는 분기점을 해부하다. 이러한 혈관, 특히 우수한 갑상선은 깨지기 수 있습니다. 절개 매우주의하십시오.
- 6-0 실크 봉합사를 사용하여 뛰어난 갑상선 위에 외부 경동맥을 묶어. 이렇게하려면 동맥 아래 한 포셉을 통과하고 다른 집게의 도움으로 precut 치료의 한 조각을 들고. 부드럽게 동맥 아래 통과 치료를 가져옵니다. 단단히 매듭에서 잡은되는 모든 주변 조직을 피하고 타이. 당신이 효과적으로 크게 다른 모델 완전한 결합을 수행합니다 프로 시저의 끝 부분에 의해, 뛰어난 갑상선 동맥의 이륙 아래 당신이 찾아낸다면.
- 같은 기술을 사용하는 한 매듭으로 내부 경동맥과 후두 동맥을 묶어.
- 봉합과 뛰어난 갑상선 동맥의 명백의 위치를 확인합니다.
- 조직 수선의 소량을 사용하여 대략적인 피부와 가까운 피부.
- 복구까지 온난 챔버에 넣어 마우스. 복구는 일반적으로 30-60분 걸립니다.
- 동물 첫 번째 24 시간 이내에 곤경에 처한 경우 사용되는 마취가 연장 통증 (예 흡입 isoflurane)를 제공하거나하지 않는 경우 Buprenorphine (0.1mg/kg)의 하나 복용량은 게시 즉시 수술을 시행해야합니다. 우리의 경험에서, 마취에 대한 관리 케타민을 복용은 수술 경험이 풍부한 외과 의사에 의해 수행되고 더 이상의 진통제가 필요하지 않습니다 충분한 진통제를 제공합니다.
2. 경동맥의 초음파 검사
- 부분 내고이 흐름을 방해 유도 여부를 확인하기 위해 경동맥 흐름은 하루 후 내고 검사를해야합니다
- isoflurane과 마취를 유도 - 필요한 경우 마취 유도 상자가 사용할 수
- 최대 이미징 단계, 배꼽쪽에 anesthetized 쥐를 플레이스
- 이미징 무대에서 ECG 센서에 테이프 팔, 다리
- 나이르의 교양 프로그램 (이미 내고 절차 완료하지 않을 경우이 단계에만 필요)의 목을 잎이 진
- 온도를 기록하는 직장 온도계를 삽입
- 목에 젤 에코 신청
- B - 모드에서 시작합니다.
- 이미징 비행기는 90도 (프로브에 손잡이가 마우스의 코를 향해 가리 켜야합니다)해야합니다
- 이미지가 얻을 때까지 마우스 목에에 프로브를 낮춥니다.
- 무대 왼쪽과 오른쪽기도까지 (중간 라인 구조) 식별 조작
- 왼쪽 일반적인 경동맥을 식별
- 틸트 영상 무대 너무 각도는 이미징 비행기와 경동맥 사이에 만들어집니다. 큰 이런 각도에서 강한 도플러 신호가 될 것입니다.
- 왼쪽 일반적인 경동맥의 중간에 자리 펄스 웨이브 도플러.
- 필요에 따라 각도 보정을 사용합니다.
- 오른쪽 공통 경동맥에서 측정을 반복합니다.
- 성공적인 부분 경동맥 내고는 심장 확장하는 동안 대동맥 입구쪽으로 흐름의 반전과 함께 오른쪽에 비해 왼쪽 일반적인 경동맥의 흐름 전반적인 감소 (~ 80-90%)가 발생합니다.
- 만족스러운 이미지를 취득했습니다 일단 마취를 해제, 테이프 레스에서 마우스와 무료 생쥐에서 젤 에코 닦아traints. 예열 복구 챔버의 생쥐를 배치합니다.
3. 경동맥 내막에서 RNA 격리
- 기관 IACUC 프로토콜에 따라 CO 2 흡입하여 마우스를 희생
- 종이 타월에 테이프 발.
- 복부에서 흉부의 상단에 마우스의 피부를 잘라.
- 가위의 날카로운 쌍의로 ribcage 아래의 복부 벽을 엽니다.
- 다이어프램을 집게로 흉골을 들어 컷 후 심장을 노출하는 ribcage 버려야.
- 가위로 베나 카바 컷.
- 폐, 간 창백한 될 때까지 좌심실을 통해 10 단위 / ML 헤파린을 포함한 정상적인 생리와 2-3 분 압력 perfuse (120 mmHg).
- 목 피부를 잘라 경동맥 동맥이 노출되기 전까지는 모든 지방, 근육 및 결합 조직을 제거하십시오.
- 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다.
- 찔린 오른쪽 두번째 재관류를 위해 왼쪽 경동맥에 내고 사이트 아래에 구멍.
- 좌측 경동맥이 잘되어 있는지 확인한하고, 좌심실을 통해 10 단위 / ML 헤파린을 포함한 정상적인 생리와 함께 ~ 1 분 다시 압력 perfuse.
- 좋은 팁 포셉 작은 봄 가위를 사용하여, 신중하게 carotids를 둘러싼 페리 - adventitial 조직을 제거합니다. 이 세척 단계에서 carotids를 당기거나 스트레칭하지 않도록주의하십시오.
- 대동맥 아치와 경동맥 분기점 위에 내고 지점 사이의 좌측 경동맥을 잘라.
- 오른쪽 쇄골 하 동맥 분기 지점과 경동맥 분기점 사이의 오른쪽 경동맥을 잘라.
- 얼음처럼 차가운 HBSS를 포함, 35mm 문화 요리에 carotids를 전송합니다. 필요한 경우, 신중하게 남아있는 페리 - adventitial 조직을 제거합니다.
- 각 경동맥 당 150 μl QIAsol의 용해 버퍼 (Qiagen)를 작성하여 29g 바늘로 인슐린 주사기 (10분의 3 ML 주사기)를 준비합니다.
- 조심스럽게 경동맥의 한쪽에 바늘의 끝부분을 삽입합니다.
- 포셉과 경동맥과 바늘의 끝을 잡고 있지만, 신속하게 (~ 1 초) (intima의 eluate) 1.5ml 튜브에 QIAsol 용해 완충액 (150 μl)를 플러시.
- 경동맥 남은 (미디어 + adventitia) 한 HBSS에서 1.5 ML 튜브에 넣어 액체 질소 스냅인 동결을 씻어.
- Intima의 eluate 및 냉동 남은 그 다음 제조 업체의 지침에 따라 miRNeasy 미니 키트 (QIAGEN)를 사용 내막 또는 미디어 + adventitia RNA 분리에 사용됩니다.
4. 대표 결과 :
우리는 부분적으로 마우스 경동맥 동맥과 초음파 검사는 다음과 같은 절차 언젠가 실시되었다 왼쪽 출혈도 잡았. 그림 1에 나타난 성공적인 부분 내고 혈액 흐름 속도를 감소시키고 심장 확장하는 동안 왼쪽 일반적인 경동맥의 흐름을 (방해 흐름) 반대. 높은 지방 음식과 함께 ApoE 녹아웃 (KO) 생쥐의 부분 내고는 왼쪽 일반 경동맥 (LCA)에 강력한 죽상 경화증을 유도하지만 contralateral 오른쪽 경동맥에서 2 주 (그림 2). 경동맥 intima에서 수집한 RNA는 PECAM - 1과 같은 내피 마커 유전자를 포함, 예 : A - SMA (그림 3)와 같은 중간 평활근 세포 마커 유전자 무료 동안.
그림 1 : 경동맥 해부학 및 ligations의 도식 : 우수한 갑상선 동맥 (STA)가 열려 떠나면서 왼쪽 일반적인 경동맥의 세 지점 (LCA) [외부 경동맥의 동맥 (ECA), 내부 경동맥 (ICA), 그리고 후두 동맥 (OA)가], 출혈도 잡았했다.
그림 2 : 초음파 이미지 유속 프로필을 표시하고 부분 내고는 심장 확장하는 동안 LCA의 흐름 반전을 (화살표로 표시) 유도 것을 공개. RCA의 흐름을 내고 이후에 변경되지 남아 있습니다.
그림 3 : 부분 내고 높은 지방 다이어트는 빠르게 ApoE KO 마우스의 LCA에 죽상 경화증을 유도 ApoE KO 마우스 부분적으로 출혈도 잡았 1로 3 주간 높은 지방 음식을 공급했다.. LCA의 냉동 섹션은 오일 - 레드 - O 물들일되었습니다.
그림 4. 내막 RNA의 준비 방법. 내막 RNA와 중간 + adventitial (M +) RNA가 가짜 운항 RCA 및 LCA C57BL에 / 6 생쥐에서 얻은되었습니다. RNAS는 PECAM - 1과 α - SMA는 내부 통제로 18 기의를 사용하는 세미 양적 RT - PCR (A) 및 qPCR (B, C)에 의해 분석되었다. 막대 그래프는 ± SEM, n은 = 3 건 있습니다.
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Discussion
이 절차에서는 외부 경동맥, 내부 경동맥, 후두 동맥과 우수한 갑상선 동맥을 포함한 일반적인 경동맥의 모든 지점의 적절한 신분증이 필요합니다. 시연으로 초음파를 사용하여 유동 패턴을 확인하는 것도 중요합니다. 우리의 경험 손에, 500 개 이상의 생쥐의 초음파 연구에 따라 부분 내고 수술의 성공 비율은 90 %보다 낫습니다. 경동맥 내막 RNA 준비 들어, 첫 번째 단계 재관류 후 경동맥의 모양에주의하는 것이 중요합니다. 이 시점에서 좌측 공통 경동맥의 흐름 차단의 증거가있다면, 우리는 추가 분석을 위해 이러한 샘플을 사용하지 않는 것이 좋습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 과학, 기술 및 S. 한국의 교육부에서 NIH 기금 HL87012 (HJ), HL75209 (HJ), UO1HL80711 (DH, DG, HJ) 및 세계 클래스 대학 프로젝트 (HJ)의 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Normal Saline (0.9% sodium chloride) | Baxter Internationl Inc. | 2B1323 | |
| Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe) | Tyco Healthcare, Covidien | 8881600145 | |
| HBSS | Cellgro | 21-023 | |
| miRNeasy mini kit (including, QIAzol) | Qiagen | 217004 | |
| Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System | VisualSonics, inc. | a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice | or similar system |
| 6-0 Silk Suture, sterile | Covidien | s-1172 c2 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5675 | or similar |
| Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | or similar |
| Tissue Mend II | Webster Veterinary | 07-856-7946 |
References
- Korshunov, V. A., Berk, B. C. Flow-induced vascular remodeling in the mouse: a model for carotid intima-media thickening. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (12), 2185-2191 (2003).
- Sullivan, C. J., Hoying, J. B. Flow-dependent remodeling in the carotid artery of fibroblast growth factor-2 knockout mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (7), 1100-1105 (2002).
- Nam, D. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (4), H1535-H1543 (2009).
