تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Summary

حذف الجينات والبروتينات overexpression طرق مشتركة لدراسة وظائف للبروتينات. في هذه المقالة ، نحن تصف بروتوكولا لتحليل تطور النمط الظاهري كدالة للتركيز البروتين في السكان وحيدة الخلية في مستويات

Abstract

حذف الجينات والبروتينات overexpression طرق مشتركة لدراسة وظائف للبروتينات. في هذه المقالة ، نحن تصف بروتوكولا لتحليل تطور النمط الظاهري كدالة للتركيز البروتين في السكان وحيدة الخلية في مستويات

Protocol

ألف خلية ثقافة والحث البروتين

هذا المقطع يصف الظروف ثقافة الخلية ، الخلية دورة التزامن مع Nocodazole ، تليها تحريض من بروتين تعبير مروج regulatable في خلايا الخميرة.

1. الخميرة النوع البري سلالة W303 (leu2 - 3 ، 112 trp1 - 1 can1 - 100 ura3 - 1 ade2 - 1 his3 - 11 ، 15) وتحولت مع نسخة عالية (2μ) DNA البلازميد الذي يحتوي على الجينات لدينا اهتمام (ENTH2) تحت السيطرة من مروج ميثيونين - repressible (MET25). 2mm وميثيونين يكفي لقمع نشاط المروج ، في حين أن وسائل الإعلام التي تفتقر إلى ميثيونين يسمح التعبير القصوى. وبالتالي ، يمكن استخدام مجموعة من تركيزات ميثيونين للتعبير عن البروتين على المستوى المطلوب. ويتم تحويل 1 من الحمض النووي البلازميد في W303 الخلايا باستخدام الأسلوب LiAc - TE وفقا للاجراءات المتبعة. ²
   ملاحظة : يجب أن يكون تنفيذ هذه التجربة من خلال زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في حضور 2mm وميثيونين لضمان التعبير عن بروتين فقط عند مستويات الخلفية. صباح اليوم التالي ، ينبغي أن يسببها بروتين تعبير الخلايا عن طريق إعادة التعليق في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الخلية مباشرة بعد ميثيونين دورة التزامن (4H تقريبا). ومع ذلك ، فقد وجدنا أن يتسبب في انقسام الخلايا التي تعتمد على النمط الظاهري ENTH2 إلا بعد تركيز كبير من ENTH2 قد تراكمت في الخلايا (عادة بعد 6H - 4 الحث البروتين ³⁾ ، وجعل دوام لتحليل كل مظاهر النمط الظاهري طويلة جدا (على الأقل 16H). لقد وجدنا أن زراعة الخلايا بين عشية وضحاها في حضور 0.2mM ميثيونين يقمع النمط الظاهري المورفولوجية دون الحرجة ، ولكنه يسمح تركيز البروتين الذي يمكن زيادة بسرعة إلى النمط الظاهري الذي يحفز مستويات عند نقلها إلى وسائل الإعلام التي تفتقر إلى ميثيونين. يسمح هذا التحليل المفصل لمظاهر خطيرة من الخلية عيب الانقسام في فترة أقصر نسبيا من الزمن. وبالتالي فإننا نوصي بأن المجرب تحديد تركيز ميثيونين أن عتبة الفرعي لتحريض النمط الظاهري على أساس كل حالة على حدة.
2. اختيار ستة مستعمرات من لوحة تحتوي على الخلايا تحولت مؤخرا ، وتطعيم في 50 مل من وسائل الإعلام الانتقائي مع 0.2mM ميثيونين في دورق مخروطي a تعقيمها باستخدام التقنيات القياسية العقيمة. يحضن بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية في مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. (لمزيد من المعلومات عن ظروف معيشية سيئة الثقافة الخميرة ، انظر المرجع 4)
3. صباح اليوم التالي خلية تقدير ، والكثافة من خلال قياس الكثافة البصرية للثقافة في ل 600Nm. نقل ما يعادل 20 OD _{ل 600Nm} من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي معقمة والحصاد من خلال الدوران في 2200 دورة في الدقيقة ل5min في درجة حرارة الغرفة.
4. خلايا Resuspend في YPD بتركيز _{ل 600Nm} OD 0.4 / مل وإضافة إلى التركيز Nocodazole النهائي من 15μg/ml من مخزون من 1mg/ml في DMSO. لاحتضان 4H في 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200rpm.
   ملاحظة : يمكن استخدام أساليب الاعتقال البديلة بما في ذلك الاعتقال في مرحلة G0 به ألفا عامل أو في المرحلة G1 - S باستخدام هيدروكسي يوريا. لقد وجدنا أن اعتقال في الانقسام باستخدام Nocodazole بسيطة وفعالة بما فيه الكفاية لأغراضنا.
5. 4H بعد ، والتحقق من نسبة الخلايا التي اعتقلت في الانقسام حساب عدد الخلايا التي تحتوي على براعم متساوية الحجم عن طريق عرض تحت المجهر. إذا كان اعتقال أكثر من 90 ٪ ، والمضي قدما إلى الخطوة التالية. خلاف ذلك ، والحفاظ على الخلايا في Nocodazole حتى يتم تحقيق النسبة المئوية المطلوبة للاعتقال الإنقسامية.
6. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 2200 دورة في الدقيقة ل5min وتغسل بماء مثلج ثلاث مرات. بعد غسل النهائي ، resuspend الكرية في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الانتقائية ميثيونين في مناطق ذات كثافة خلية _{ل 600Nm} ~ OD 0.5 / مل. نقل نصف حجم الخلايا لأنبوب عقيمة جديدة وإضافة إلى التركيز إلى ميثيونين 0.2mM النهائي. هذا سوف يكون بمثابة الرقابة على الآثار الناجمة عن المستويات القاعدية للتعبير البروتين. هذا يمثل نقطة لأول مرة من التجربة (الوقت = 0h). تحليل الخلايا كل ساعة لمدة 6H.

باء تحليل التنمية النمط الظاهري

ملاحظة : جميع طرق التحليل المذكورة أدناه لا تحتاج إلى أن يقوم في نفس الوقت.

تحديد مستويات بروتين تعبير بواسطة الغربية التنشيف

1. في كل نقطة في الوقت ، وقياس _{ل 600Nm} OD للثقافة والحصاد 2 ​​OD _{ل 600Nm} حكمه من الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
2. Resuspend الكرية 1ml في الماء المعقم ونقل إلى تعليق أنبوب إيبندورف 1.5ml. كرر الطرد المركزي للحصول على بيليه. نضح لطاف.
3. Resuspend الكرية في SDS - PAGE 50μl العازلة laemmli العينة (6.8 درجة الحموضة 50mM تريس ، 2 ٪ SDS ، الجلسرين 10 ٪ و 2 ٪ β - 0.006 ٪ والمركابتويثانول bromophenol الزرقاء). إضافة 50μl من الخرز الزجاجي حمض غسلها (0،2-0،4 ميكرون قطر) ، ودوامة لمدة 1 دقيقة.
4. أنابيب تغلي على حرارة 95 درجة مئوية بلوالمسيخ لمدة 2 دقيقة ، الدوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية ، واستئناف المغلي لمدة 5 دقائق. تجميد البروتين في عينة -20 درجة مئوية.
5. تشغيل عينات البروتين على جل SDS - PAGE 12 ٪ ، ونقل على غشاء النيتروسليلوز وأداء الغربية النشاف مع الأجسام المضادة المناسبة للكشف عن البروتين من الفائدة. في هذا المثال ، ونحن التحقيق وجود الهيماغلوتينين (HA) الموسومة المجالات التي يحتضنها ENTH مع الأضداد المضادة للHA الماوس (كوفانس ، برنستون ، نيوجيرسي) في التخفيف 1:2000 في Blotto - توين (1XPBS ، 5 ​​٪ غير دهن الحليب الجاف ، 0.1 ٪ توين). HRP الموسومة الماعز المضادة للجسم الفأر الثانوية (بيرس) في التخفيف من 1:2500 ، وأيضا في Blotto - توين ، لا يسمح لربط الأجسام المضادة في المقام الأول على الغشاء عن 1H في درجة حرارة الغرفة. يستخدم Supersignal الركيزة بيكو Chemiluminescent الغربية للكشف عن الأجسام المضادة الموسومة HRP الماوس المضادة.
6. قياس مستويات بروتين تعبير عن طريق قياس كثافة.

يصف هذا القسم طريقتين تتبع النمط الظاهري للتنمية بوصفها وظيفة من زيادة تركيز البروتين. هو خلية السكان يستند الأسلوب الأول ، في حين أن الدراسات الثانية أنه على مستوى خلية واحدة.

الكمي للخلية تقسيم النمط الظاهري وموت الخلايا

1. في كل نقطة في الوقت ، ونقل 1ml تعليق خلية إلى أنبوب إيبندورف العقيمة باستخدام تقنيات الحصاد العقيمة والخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
2. نضح في وطاف resuspend الكرية في 70μl وسائل الإعلام ، تليها 30μl الميثيلين الأزرق من مخزون من المياه في 1mg/ml العقيمة. أزرق الميثيلين هو صبغة زرقاء الحيوي الذي يصبح عديم اللون في البيئة الحد من العصارة الخلوية وبالتالي يمكن التعرف على الخلايا الميتة التي لونها زرقاء.
3. ماصة ~ 6μl من هذا التعليق على شريحة زجاجية نظيفة ووضع ساترة على الهبوط. اضغط بلطف ساترة لتشكيل رقيقة ، وطبقة من الخلايا موحدة بين واجهات زجاجية.
4. تقسيم ساترة في الأرباع 9 3 ، واتخاذ الصور في كل رباعي كما هو مبين في الشكل. 2. يجب أن يكون عدد الخلايا / أن يكون هناك مجال أكبر من 30 خلايا للسماح الكمي دقيقة. ولا يمكن تصوير كل ساترة لحوالي 15 دقيقة قبل فقاعات الهواء تلف التحضير.
5. حساب عدد الخلايا التي تبين النمط الظاهري قيد الدراسة. الخلل الناجم عن انقسام الخلية عند ENTH2 overexpression يؤدي إلى موت الخلية ، وبالتالي ، نحن نعول أيضا على عدد من الخلايا الميتة التي حددتها لونها زرقاء.
6. حساب النسبة المئوية للخلايا المظهري.
7. رسم البيانات كما هو موضح في الشكل. 3.

التصور عيوب محددة النمط الظاهري باستخدام المجهر مضان

خلية تقسيم الخلايا التالفة ، كما رأينا عند ENTH2 overexpression ، وغالبا ما تتميز عن عيوب جدار الخلية وseptin mislocalization3 (كما تصور GFP الانصهار البروتينات). لا يمكن للجدار الخلية من الخميرة في مهدها يمكن بسهولة تصور من قبل تلطيخ مع الأبيض Calcofluor (CFW) الذي يربط بشكل لا رجعة فيه لالكيتين في جدران الخلايا الخميرة.

1. في كل مرة 1ml نقطة قسامة ، الثقافة في أنبوب إيبندورف عقيمة وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 2200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. Resuspend الكرية خلية في 100μl حل CFW 1mg/ml في الماء المعقم واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
3. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي ، ويغسل 3 مرات مع 1X PBS.
4. Resuspend وبيليه في برنامج تلفزيوني 100μl 1X والصورة تحت المجهر باستخدام الأشعة فوق البنفسجية البصريات (جدار الخلية) وFITC تصفية (GFP - septin) في التكبير 100X.
5. تحديد نسبة الخلايا التي تحتوي على عيب جدار الخلية وmislocalization septin باتباع الخطوات 4-6 في القسم B.2.1

B.3. تقرير التنمية النمط الظاهري على مستوى الخلية واحد : الزمن الفاصل بين المجهري الفيديو.

1. تنظيف شريحة زجاجية مقعرة مع الاكتئاب مع الكحول 70 ٪ والسماح للهواء الجاف.
2. تغلي 0.06g agarose في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الانتقائية 5ml ميثيونين في أنبوب زجاجي معقم في الميكروويف حتى agarose يذوب تماما.
3. بسرعة 200μl ماصة للagarose تحتوي على وسائل الإعلام في الاكتئاب وعكس الشريحة شريحة أخرى من الزجاج النظيف أكثر من ذلك ، التأكد من أن أي محاصرون فقاعات الهواء تحتها.
4. عندما يتصلب هلام ، حرك الشريحة على رأس بسلاسة بعيدا عن الشريحة والاكتئاب ، والحفاظ على سطوحها موازية في جميع الأوقات. هذا يضمن أن سطح السرير agarose هو مطاردة مع سطح الشريحة الاكتئاب. تنظيف المنطقة المحيطة الشريحة السرير agarose بمنديل الحساسة. الشريحة الآن جاهزة للاستخدام.
5. في الوقت = 4 ساعات ، 1ml نقل الخلايا من ثقافة إلى أنبوب إيبندورف معقمة والحصاد بواسطة الطرد المركزي في 2200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة : من المستحسن وقت لاحق سيتم اختيار نقطة لضمان مستويات عالية من بروتين تعبير بحيث يتم ضمان أن التنمية النمط الظاهري. هناك حاجة لتجارب رائدة determinه مرات الحث على أساس كل حالة على حدة.
6. نضح الخلايا وطاف resuspend 100μl في وسائل الإعلام التي تفتقر إلى الانتقائية الطازجة ميثيونين.
7. تطبيق الفازلين على حواف ساترة. ثم ضع قطرة من تعليق الخلية في وسط السرير agarose وانتشارها بشكل موحد عن طريق الضغط بلطف ساترة فوقها.
8. ختم حواف ساترة مع الفازلين وتحديد موقفها من بطانة حواف مع طلاء الأظافر. انتظر حتى يجف وطلاء الأظافر.
9. ضع الشريحة في مرحلة ساخنة من المجهر واختيار الحقل الذي يحتوي على ما لا يزيد عن 10 خلايا متباعدة بشكل كاف. وانقسام الخلايا ، وسوف تحصل مزدحمة الميدان على مر الزمن.
10. التقاط صورة لحقل كل 5 دقائق لساعات 5 ~. ويمكن دراسة تطور النمط الظاهري عن طريق تجميع الصور في الفيلم باستخدام ImageJ البرمجيات ( Rasband ، وكان ، ImageJ الأميركية ، والمعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا بولاية ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية ، http://rsb.info.nih.gov/ij/ ، 1997 -2005 )

ملاحظة : نحن نستخدم زايس مجهر 200M Axiovert ، زايس Axiocam MRM كاميرا رقمية أحادية اللون وكارل زايس صورة Axiovision اقتناء البرمجيات (الإصدار 4.4) لتصوير الخلايا الحية. يتحقق التحكم في درجة الحرارة عن طريق وضع الشرائح على الحفاظ على مرحلة ساخنة في 30 درجة مئوية قبل الجهاز PeCon 37 Tempcontrol.

تفاديا لإعادة ضبط التركيز مرارا وتكرارا ، وأنها مريحة للبرنامج البرنامج الحصول على الصور تلقائيا للحصول على عدد قليل من الصور ض المكدس في كل نقطة من الوقت واختيار أفضل صورة مع التركيز في وقت لاحق عند تجميع الفيلم. بعض برامج التقاط صور لديها خيار ضبط تلقائي للتجارب دوام. وهو ملائمة لاستخدام هذا الخيار في حال توافرها.

البرية تنمو خلايا الخميرة النوع الأفضل في التحكم في درجة الحرارة 30 درجة مئوية وبالتالي أمر بالغ الأهمية. من أجل ضمان الحرارة الكافية ، فمن المفيد أن توفر مصدر خارجي للحرارة ، بالإضافة إلى مرحلة ساخنة. على سبيل المثال ، أن نترك الضوء الأبيض المنقولة من المجهر لمدة يوم كامل من التصوير.

كما أن من الأهمية لتجنب فقاعات الهواء عند إعداد السرير agarose وشطيرة الخلية. في الهواء المحبوسة داخل فقاعات يوسع عند تسخينها مع مرور الوقت ، وتميل إلى دفع الخلايا التي يجري تصويرها بعيدا عن الميدان.

من المهم أيضا لضمان أن المواقف الفردية ضمن الخلية الحقل لا تتغير بشكل ملحوظ خلال فترة عملية التصوير ، وخصوصا خلال إعادة تركيز المحاولات. الإضافات تثبيت الصورة غير متوفرة للImageJ لتصحيح الموقف تحولات صغيرة في الخلية بعد أن تم تجميع الفيلم. ( http://www.cs.cmu.edu/ kangli ~ / / رمز Image_Stabilizer.html ).

Discussion

هذا البروتوكول وصف كيفية رصد تطور النمط الظاهري المورفولوجية (خلية الخميرة غير قادر على الخضوع لانقسام الخلايا السليمة) على overexpression البروتين. عندما تفعل هذا الإجراء أنه من المهم أن نتذكر أن حصاد خلايا الخميرة التي التكوير في سرعة الطرد المركزي على النحو الموصى به أسرع بسرعة قد يؤدي إلى تلف الخلايا ونتائج غامضة. وينبغي أن يضاف الميثيلين الأزرق والأبيض Calcofluor العيش الخلايا فقط قبل التصوير لأنها سامة. ويمكن أيضا هذا الإجراء أن تتكيف بسهولة لاحظ الظواهر في ظل ظروف القمع البروتين ، شريطة يعبر عن الهدف من المروج السيطرة عليها.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2