ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Summary

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות

Abstract

המחיקה ין overexpression חלבון שיטות משותף ללימוד פונקציות של חלבונים. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח התפתחות פנוטיפ כפונקציה של ריכוז החלבון על האוכלוסייה תא בודד רמות

Protocol

א התרבות תאים אינדוקציה חלבון

סעיף זה מתאר תרבית תאים התנאים, מחזור התא סנכרון עם Nocodazole, ואחריו אינדוקציה של ביטוי חלבון מן מקדם regulatable בתאי שמרים.

1. סוג בר שמרים זן W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) הופך עם העתק גבוהה (2μ) DNA פלסמיד המכיל את הגן שלנו עניין (ENTH2) תחת שליטה האמרגן של מתיונין-repressible (MET25). 2mm מתיונין מספיקה כדי לדכא את פעילות הפרומוטר, בעוד התקשורת חסר מתיונין מאפשר ביטוי מקסימלי. לפיכך, בטווח של ריכוזי מתיונין ניתן להשתמש כדי להביע את החלבון ברמה הרצויה. 1 טרנספורמציה של DNA פלסמיד ב W303 התאים מתבצע בשיטת LiAc-TE על פי נהלים קבועים. ²
   הערה: הניסוי צריך להתבצע על ידי גידול התאים לילה בנוכחות 2mm מתיונין כדי להבטיח ביטוי חלבון רק ברמות הרקע. למחרת בבוקר, ביטוי חלבון צריך להיגרם על ידי resuspending התאים בתקשורת חסר מתיונין מיד סנכרון הבאים לתא מחזור (4H כ). עם זאת, מצאנו כי ENTH2 תלוי פנוטיפ חלוקת התא מושרה רק לאחר ריכוז ניכר של ENTH2 בנתה בתאים (בדרך כלל אחרי 4-6 שעות של אינדוקציה חלבון ^3), מה שהופך את מהלך הזמן לניתוח של כל גילויי את הפנוטיפ ארוך מאוד (לפחות 16h). מצאנו כי גידול התאים לילה בנוכחות 0.2mM מתיונין מדכא את הפנוטיפ מורפולוגיים אך מאפשר ריכוז חלבון subcritical כי ניתן להגדיל במהירות פנוטיפ וישכנע רמות כאשר הועברה המדיה חסר מתיונין. זה מאפשר ניתוח מפורט של ביטויים חמורים של הפגם חלוקת התא בתקופה יחסית קצרה של זמן. ולכן אנו ממליצים כי הניסוי לקבוע את ריכוז מתיונין זה משנה סף לזירוז הפנוטיפ על בסיס כל מקרה לגופו.
2. פיק six מושבות מהצלחת המכיל תאים הפך לאחרונה לחסן ב 50 מ"ל של התקשורת סלקטיבית עם 0.2mM מתיונין בבקבוק חרוטי עיקור באמצעות טכניקות סטנדרטיות סטרילי. דגירה לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 200 סל"ד. (למידע נוסף על התנאים תרבות תקן שמרים, ראה השופט. 4)
3. למחרת בבוקר, תא להעריך צפיפות על ידי מדידת צפיפות אופטית של התרבות ב 600nm. מעבירים את שווה ערך ל 20 OD _600nm של תאים לתוך צינור צנטריפוגות הקציר סטרילית ידי מסתובב בסל"ד 2200 עבור 5min בטמפרטורת החדר.
4. תאים Resuspend ב YPD בריכוז של 0.4 OD _600nm / ml ולהוסיף Nocodazole לריכוז סופי של 15μg/ml של ממלאי של 1mg/ml ב DMSO. דגירה של 4H על 30 מעלות צלזיוס עם רעד בכל 200rpm.
   הערה: מעצר אלטרנטיבית בשיטות כולל מעצר בשלב G0 באמצעות אלפא גורם או בשלב G1-S באמצעות hydroxyurea ניתן להשתמש. מצאנו כי מעצר בבית מיטוזה באמצעות Nocodazole הוא פשוט ויעיל מספיק לצרכים שלנו.
5. לאחר 4H, לבדוק את אחוז התאים נעצר מיטוזה על ידי ספירת מספר התאים עם בלוטות בגודל שווה ידי צפייה במיקרוסקופ. אם המעצר עולה על 90%, המשך לשלב הבא. אחרת, לשמור על התאים Nocodazole עד האחוז הרצוי המעצר mitotic מושגת.
6. קציר תאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2200 עבור 5min ולשטוף עם מים קרים כקרח שלוש פעמים. לאחר לשטוף הסופי, resuspend גלולה בתקשורת סלקטיבית חסר מתיונין בצפיפות תא של ~ 0.5 OD _600nm / ml. העברת חצי נפח התאים צינור סטרילי חדשה ולהוסיף מתיונין לריכוז 0.2mM הסופי. זה ישמש לשלוט על ההשפעות בשל רמות הבסיס של ביטוי חלבון. זה מסמן את הפעם הראשונה לנקודה של הניסוי (זמן = 0h). ניתוח תאים כל שעה למשך 6 שעות.

ב ניתוח ופיתוח הפנוטיפ

הערה: כל השיטות המתוארות להלן ניתוח לא צריכים להתבצע בעת ובעונה אחת.

קביעת רמות ביטוי חלבון ע"י המערבי סופג

1. בשלב מסוים, בכל פעם, למדוד את OD _600nm של התרבות וקציר 2 OD _600nm ושווי של תאים על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל"ד במשך 5 דקות.
2. Resuspend גלולה במים 1ml סטרילי ולהעביר את ההשעיה לצינור Eppendorf 1.5ml. חזור על צנטריפוגה להשיג גלולה. לשאוב supernatant.
3. Resuspend גלולה במאגר 50μl laemmli SDS-PAGE מדגם (50mm טריס pH 6.8, 2% SDS, גליצרול 10%, 2% ו - β-mercaptoethanol 0.006% bromophenol כחול). הוסף 50μl של חומצה שטף חרוזי זכוכית (קוטר 0.2-0.4 מיקרון) ו מערבולת דקות 1.
4. מרתיחים צינורות על 95 מעלות חום block במשך 2 דקות, מערבולת שוב למשך 30 שניות ולהמשיך רותחים במשך 5 דקות. להקפיא את דגימת החלבון ב -20 ° C.
5. הפעל דגימות חלבון על ג'ל SDS-PAGE 12%, להעביר על קרום nitrocellulose ולבצע המערבי סופג עם נוגדנים המתאימים כדי לזהות את החלבון של עניין. בדוגמה זו, אנו לחקור את נוכחותו של haemagglutinin (HA) מתויג תחומים ENTH ידי דוגרים עם נוגדן אנטי HA העכבר (Covance, Princeton, NJ) בדילול 1:2000 ב-Tween שיכור סחוט (1XPBS, 5% שומן לא יבש החלב , 0.1% Tween). HRP tagged אנטי עכבר עז נוגדנים משני (פירס) בשעה דילול של 1:2500, גם שיכור סחוט-Tween, מותר לקשור את הנוגדן הראשוני על הממברנה עבור 1h בטמפרטורת החדר. Supersignal תשתית מערב פיקו Chemiluminescent משמש כדי לזהות HRP מתויג נוגדן אנטי העכבר.
6. לכמת ביטוי החלבון על ידי רמות צפיפות.

סעיף זה מתאר שתי שיטות פיתוח פנוטיפ מעקב כפונקציה של ריכוז החלבון גוברת. השיטה הראשונה היא התא האוכלוסייה המבוססת, בעוד מחקרים השניה ברמה של תא בודד.

כימות פנוטיפ חלוקת התא ומוות התא

1. בנקודה זו בזמן, העברת ההשעיה תא 1ml לצינור Eppendorf סטרילי תוך שימוש בטכניקות סטריליות ותאי הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל"ד במשך 5 דקות.
2. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 70μl התקשורת, ואחריו 30μl מתילן כחול מלאי של 1mg/ml במים סטריליים. מתילן כחול הוא צבע כחול חיוני זה הופך להיות חסר צבע בסביבה צמצום של cytosol ולכן התאים המתים יכולים להיות מזוהים על ידי הצבע הכחול שלהם.
3. פיפטה ~ 6μl של השעיה זו בשקופית זכוכית נקי במקום coverslip על הירידה. לחצו על coverslip בעדינות כדי ליצור שכבה דקה ואחידה של תאים בין ממשקים זכוכית.
4. מחלקים את coverslip לתוך 9 הרביעים ולקחת 3 תמונות לכל רביע, כמצוין באיור. 2. מספר תאים / שדה צריך להיות יותר מ 30 תאים כדי לאפשר כימות מדויק. כל coverslip ניתן הדמיה במשך כ 15 דקות לפני בועות אוויר הנזק הכנה.
5. ספירת התאים מראה את הפנוטיפ תחת מחקר. חלוקת התא פגם המושרה על overexpression ENTH2 מוביל מוות של תאים, ולכן, אנחנו גם לספור את מספר התאים המתים זוהו על ידי הצבע הכחול שלהם.
6. חישוב אחוזי התאים פנוטיפי.
7. מגרש את הנתונים כפי שמוצג באיור. 3.

ויזואליזציה של פגמים ספציפיים הפנוטיפ באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Cell-חלוקת תאים פגומים, כפי שניתן לראות על overexpression ENTH2, מאופיינים לעיתים קרובות על ידי תא הקיר פגמים septin mislocalization3 (דמיינו כמו GFP-Fusion חלבונים). דופן התא של שמרים ניצני יכול בקלות להיות דמיינו ידי מכתים עם Calcofluor לבן (CfW) אשר נקשר באופן בלתי הפיך עד כיטין בקירות תא שמרים.

1. באותה נקודה בכל פעם, 1ml aliquot תרבות צינור Eppendorf סטרילית תאים הקציר על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. Resuspend התא גלולה ב 100μl של פתרון CfW 1mg/ml במים דגירה סטרילי במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
3. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ולשטוף 3 פעמים עם 1X PBS.
4. Resuspend גלולה ב 100μl 1X PBS ותמונה תחת מיקרוסקופ באמצעות אופטיקה UV (תא הקיר) ואת FITC המסנן (GFP-septin) בהגדלה 100x.
5. לכמת אחוז התאים עם הפגם תא קיר mislocalization septin על ידי השלבים הבאים 4-6 בסעיף B.2.1

ב .3. קביעת התפתחות פנוטיפ ברמת תא בודד: זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו.

1. נקה שקופיות זכוכית עם דיכאון קעורה עם אלכוהול 70% ולאפשר לאוויר יבש.
2. מרתיחים 0.06g agarose בתקשורת סלקטיבית 5 מ"ל חסר מתיונין בתוך שפופרת זכוכית סטרילית במיקרוגל עד agarose נמס לחלוטין.
3. במהירות 200μl פיפטה של ​​agarose המכיל התקשורת הדיכאון שקופיות להפוך עוד שקופיות זכוכית נקי על זה, כדי לוודא ששום בועות אוויר לכודים מתחתיו.
4. כאשר הג'ל מחזקת, להעביר את השקף על גבי חלק מן השקופית דיכאון, לשמור על פני השטח שלהן במקביל בכל עת. זה מבטיח את פני השטח של המיטה agarose הוא מיושר עם פני השטח של השקופית דיכאון. נקו את האזור סביב המיטה שקופיות agarose עם רקמה עדינה. השקופית עכשיו הוא מוכן לשימוש.
5. באותו זמן = 4 שעות, 1ml העברת תאים מתרבות לצינור Eppendorf הקציר סטרילית על ידי צנטריפוגה ב 2200 סל"ד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: מומלץ מאוחר יותר זמן נקודה להיבחר כדי להבטיח רמות גבוהות של ביטוי חלבון, כך התפתחות פנוטיפ מובטחת. ניסויי פיילוט נדרשים determinדואר פעמים אינדוקציה על בסיס כל מקרה לגופו.
6. לשאוב את התאים supernatant ו resuspend ב 100μl התקשורת סלקטיבית טרי חסר מתיונין.
7. החל וזלין את הקצוות של coverslip. אז במקום ירידה של השעיה תא במרכז המיטה agarose ולהפיץ באופן אחיד על ידי לחיצה בעדינות coverslip עליהם.
8. חותם את הקצוות של coverslip עם וזלין ולתקן את מעמדה על ידי רירית קצוות עם לק. המתן עד מייבש לק.
9. הנח את השקף על הבמה סוער של מיקרוסקופ ולבחור השדה המכיל לא יותר מ 10 תאים מרווחים כראוי. כאשר התאים מתחלקים, השדה יקבל צפוף לאורך זמן.
10. קח תמונה של שדה כל 5 דקות ~ 5 שעות. התקדמות הפנוטיפ ניתן ללמוד על ידי הרכבת את התמונות לסרט באמצעות ImageJ תוכנה ( Rasband, היה, ImageJ, ארה"ב National Institutes of Health, Bethesda, מרילנד, ארה"ב, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

הערה: אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss 200 מיליון Axiovert, מונוכרום Zeiss AxioCam MRM מצלמה דיגיטלית ו Carl Zeiss רכישת AxioVision תמונת התוכנה (גירסה 4.4) עבור הדמיה תא חי. בקרת טמפרטורת הגוף מושגת על ידי הצבת שקופיות על הבמה מחוממת שמרו על 30 מעלות צלזיוס על ידי המכשיר Tempcontrol 37 Pecon.

על מנת להימנע מחדש התאמת להתמקד שוב ושוב, נוח בתוכנה רכישת התמונה באופן אוטומטי לרכוש כמה Z-מחסנית תמונות בנקודת זמן כל לבחור את התמונה הטובה ביותר עם ​​דגש מאוחר יותר, כאשר הרכבת את הסרט. כמה תוכנות רכישת תמונה יש אפשרות פוקוס אוטומטי עבור ניסויים כמובן זמן. זה נוח להשתמש באפשרות זו כאשר זמין.

Wild שמרים תאים סוג לגדול הטובה ביותר ב 30 מעלות צלזיוס ומכאן בקרת טמפרטורה היא קריטית. על מנת להבטיח מספיק חום, כדאי לספק מקור חום חיצוני בנוסף לבמה מחומם. לדוגמה, אנו עוזבים את אור לבן המשודר של המיקרוסקופ במשך כל תקופת הדמיה.

זה גם קריטי כדי למנוע בועות אוויר בעת הכנת את המיטה agarose כריך בתא. אוויר לכוד בתוך בועות מתרחב כאשר מחומם לאורך זמן נוטים לדחוף את התאים מן השדה להיות הדמיה.

חשוב גם להבטיח כי עמדות תאים בודדים בתוך השדה לא משתנים במידה ניכרת על משך תהליך הדמיה, במיוחד בתקופת מחדש התמקדות ניסיונות. ייצוב תמונה plugins זמינים עבור ImageJ לתקן משמרות קטן בעמדה תא אחרי הסרט כבר נאספו. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / קוד / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לפקח על התפתחות פנוטיפ מורפולוגיים (תא שמרים מסוגלים לעבור חלוקת התא הנכון) על overexpression חלבון. כאשר עושים את זה הליך חשוב לזכור לקצור תאים שמרים ידי pelleting במהירות צנטריפוגה מומלץ מהירויות גבוהות עלולה לגרום נזק לתאים תוצאות מעורפלות. מתילן כחול Calcofluor לבן יש להוסיף לחיות התאים בדיוק לפני הדמיה כפי שהם רעילים. הליך זה יכול גם להיות מותאם בקלות פנוטיפים נצפתה בתנאי דיכוי חלבון, ובלבד היעד מתבטאת מן מקדם לשליטה.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2