버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Summary

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명

Abstract

유전자 삭제 및 단백질 overexpression은 단백질의 기능을 연구하는 일반적인 방법입니다. 이 문서에서는, 우리는 인구의 단백질 농도의 기능 및 단일 세포 수준으로 표현형 개발의 분석을 위해 프로토콜을 설명

Protocol

A.의 세포 배양 및 단백질 유도

이 섹션은 효모 세포에서 regulatable 발기인의 단백질 표현의 유도로 다음 세포 배양 조건, Nocodazole와 세포주기 동기화를 설명합니다.

1. 야생 유형 효모 스트레인 W303 (leu2 - 3, 112 trp1 - 1 can1 - 100 ura3 - 1 ade2 - 1 his3 - 11, 15)은 통제하에 관심을 우리의 유전자 (ENTH2)이 포함되어 높은 사본 (2μ) 플라스미드 DNA로 변환됩니다 메티오닌 - repressible 발기인 (MET25)의. 메티오닌 부족한 미디어 최대한의 표현을 허용하면서 메티오닌 2mM는 모터의 활동을 억제하기 위해 충분하다. 따라서, 메티오닌 농도의 범위가 원하는 수준에서 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. W303 세포에 플라스미드 DNA의 1 변환은 표준 절차에 따라 LiAc - TE 방법을 사용하여 이루어집니다 ^2.
   참고 :이 실험에만 배경 수준의 단백질 발현을 위해 메티오닌 2mM 앞에서 밤새 세포를 성장에 의해 수행되어야합니다. 다음 날 아침은 단백질 표현식은 메티오닌 즉시 다음과 같은 세포주기 동기화 (약 4h) 부족 미디어 세포를 resuspending에 의해 유도해야합니다. 그러나, 우리는 모든 발현의 분석을위한 시간 코스를 만드는 ENTH2 의존 세포 분열의 표현형가 (일반적으로 단백질 유도 ³ 4 - 6h 후) ENTH2 상당한 농도가 세포에 지어진 후에야 유도 것으로 나타났습니다 매우 긴 표현형 (적어도 16h). 우리는 메티오닌 0.2mM 앞에서 밤새 세포를 성장하면 형태학의 표현형을 represses하지만 부족한 메티오닌 미디어로 전송하면 빠르게 표현형 - 유도 수준을 증가시킬 수있는 임계 단백질 농도를 허용 것으로 나타났습니다. 이것은 시간의 비교적 짧은 기간 동안 세포 분열의 심각한 결함의 발현의 상세한 분석을 수 있습니다. 우리는 그러므로 실험자가 건별로 표현형 유도를위한 하위 임계값있는 메티오닌 농도를 결정하는 것이 좋습니다.
2. 표준 무균 기술을 사용하여 소독 원뿔형 플라스크에 메티오닌 0.2mM과 선택적 미디어 50 ML 최근 변형 세포와 예방을 포함하는 접시 6 식민지를 선택하십시오. 30 밤새 품어 ° 200 rpm으로 흔들어로 C. (표준 효모 문화 조건에 대한 자세한 내용은 심판을 참조하십시오. 4)
3. 600nm에서 문화의 광학 밀도를 측정하여 다음 날 아침, 견적 세포 밀도. 상온에서 5 분을 위해 2200 RPM의 회전에 의해 멸균 원심 분리기 튜브 및 수확에 세포의 20 OD _600nm에 동등한를 전송합니다.
4. 에 Resuspend 세포는 0.4 OD _600nm / ML의 농도에 YPD과 DMSO의 1mg/ml의 혈통의 15μg/ml의 최종 농도 Nocodazole를 추가합니다. 200rpm에서 잡고 30 ° C에서 4h을위한 부화.
   참고 : 알파 팩터를 사용하여 G0 단계 또는 hydroxyurea를 사용하여 G1 - S 단계에서 체포를 포함한 대체 체포 방법을 사용할 수 있습니다. 우리는 Nocodazole를 사용하여 유사 분열에 체포 단순하고 우리의 목적을 위해 충분한 효과적인 것으로 나타났습니다.
5. 4h 후, 현미경으로 확인하여 동일한 크기의 꽃봉오리와 함께 세포의 수를 계산하여 유사 분열에 체포 세포의 비율을 확인합니다. 체포 이상 90 %면, 다음 단계로 진행합니다. mitotic 연금의 원하는 비율이 달성될 때까지 그렇지 않으면, Nocodazole의 세포를 유지합니다.
6. 2,200 RPM에 대한 5 분 얼음 냉수로 세 번 씻어에서 원심 분리하여 세포를 수확. 최종 세척 후 ~ 0.5 OD _600nm / ML의 세포 밀도에서 메티오닌을 선택 부족한 매체의 펠렛을 resuspend. 새로운 멸균 튜브에 세포의 절반 볼륨을 전송하고 최종 0.2mM 농도 메티오닌 추가할 수 있습니다. 이것은 단백질 표현의 기초 단계에 따라 효과를 제어하는​​ 역할을합니다. 이것은 (시간 = 오) 실험 시간 포인트를 먼저 표시합니다. 6h에 대한 세포 매 시간마다를 분석합니다.

표현형 개발 B. 분석

참고 : 아래에서 설명하는 모든 분석 방법이 동시에 수행될 필요가 없습니다.

서쪽은 모래 바닥으로 단백질 표현 수준의 결정

1. 모든 시간 시점에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 문화와 수확 세포 2 OD _600nm 등가물의 OD _600nm를 측정합니다.
2. 1ml 멸균 물의 펠렛을 Resuspend하고 1.5ml eppendorf 튜브에 현탁액을 전송하기만하면됩니다. 펠렛을 얻기 위해 원심 분리를 반복합니다. 뜨는을 대기음.
3. 50μl SDS - PAGE laemmli 샘플 버퍼 (50mM 트리스 산도 6.8, 2퍼센트 SDS, 10 % 글리세롤, 2퍼센트 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.006 % bromophenol 파란색)의 펠렛을 Resuspend. 산성 - 세탁 유리 비즈 (0.2-0.4 미크론의 직경) 1 분 소용돌이 50μl를 추가합니다.
4. 95 ° C 열 blo에 보일 튜브2 분에 대한 CK 30 초에 다시 소용돌이로 5 분 위해 끓는 이력서. -20 ° C.에서 단백질 샘플을 프리즈
5. nitrocellulose 막에 12% SDS - PAGE 젤, 전송에 대한 단백질 샘플을 실행하고 서양 관심의 단백질을 감지하기 위해 적절한 항체와 모래 바닥 수행합니다. 이 예제에서, 우리는 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2000 희석 (1XPBS 5 %가 아닌 지방 건조 우유에서 마우스 반대 HA 항체 (Covance, 프린스턴, 뉴저지)과 잠복기에 의해 ENTH 도메인 태그 haemagglutinin (HA)의 존재를 프로브 , 0.1 % 트윈). HRP는 또한 블로토 영화사 - 트윈에서 1:2500의 희석에 염소 방지 마우스 차 항체 (피어스)를 태그로 실온에서 1 시간을위한 멤브레인에 기본 항체를 바인딩할 수 있습니다. Supersignal 웨스트 피코 Chemiluminescent 기판은 HRP 태그 방지 마우스 항체를 감지하는 데 사용됩니다.
6. densitometry로 단백질 발현 수준을 계량.

이 섹션에서는 증가 단백질 농도의 함수로 추적 표현형 개발의 두 가지 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 셀 인구, 기반하는 동안 단일 세포 수준에서 두 번째 연구 해.

셀 - 분할 표현형 및 세포 사망의 부량

1. 각 시간 시점에서 5 분 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 기술과 수확 세포를 사용하여 살균 eppendorf 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전송할 수 있습니다.
2. 뜨는을 기음과 멸균 물 속에 1mg/ml의 주식에서 파란색 30μl 메틸렌 다음 70μl 미디어 펠렛을 resuspend. 메틸렌 블루가 그걸 싫어해요, 그래서 죽은 세포 their 파란색으로 식별 수 cytosol of the 줄이는 환경에서 무색이되는 파란색 중요한 염색이지.
3. 피펫 ~ 깨끗한 유리 슬라이드에이 중지 6μl하고 드롭을 통해 coverslip을 넣으십시오. 유리 인터페이스 사이 세포의 얇은, 균일한 층을 형성 부드럽게 coverslip을 누르십시오.
4. 9 quadrants로 coverslip을 분할하여 같은 그림에 표시된 사분 당 3 이미지를 가져가라. 2. 세포 / 필드의 숫자는 정확 부량 수 있도록 30 세포보다 더 클 수 없습니다. 공기 방울이 준비를 손상하기 전에 각 coverslip 약 15 분에 대한 몇 군데 있습니다.
5. 연구에서 표현형을 보여주는 세포의 수를 계산합니다. ENTH2 overexpression에 유도된 세포 분열 결함은 세포 사망에 이르게하며 따라서, 우리는 또한 파란색으로 식별 죽은 세포의 개수를 계산합니다.
6. phenotypic 세포의 비율을 계산합니다.
7. 로 그림에 표시된 데이터를 플롯. 3.

형광 현미경을 사용하여 표현형 특정 결함의 시각화

로 ENTH2 overexpression시 본 세포 분열에 결함이 세포는, 종종 세포 벽에 결함 septin mislocalization3 (GFP - 퓨전 단백질로서 시각)에 의해 특징입니다. 신진 효모의 세포 벽 쉽게 효모 세포 벽에 키틴을 irreversibly 바인딩 Calcofluor 화이트 (CfW)와 얼룩에 의해 시각하실 수 있습니다.

1. 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브 및 수확 세포의 문화 때마다 포인트, 나누어지는의 1ml에.
2. 어둠 속에서 실온에서 5 분에 대한 살균 물, 부화에 1mg/ml CfW 솔루션 100μl의 세포 펠렛을 Resuspend.
3. 원심 분리 및 1X PBS로 3 번 세척하여 수확 세포.
4. 100X 확대에 100μl 1X PBS의 펠렛 및 자외선 광을 사용하여 현미경 이미지 (세포 벽)와 FITC 필터 (GFP - septin)를 Resuspend.
5. 섹션 B.2.1에서 다음 단계를 4-6으로 세포 벽의 결함과 septin mislocalization와 함께 세포의 비율을 계량

B.3. 단일 세포 수준에서 표현형 개발의 결정 : 시간 ​​저속 비디오 현미경.

1. 70 % 알코올로 오목 우울증이있는 유리 슬라이드를 깨끗하고 건조한 공기 수 있습니다.
2. 아가로 오스가 완전히 해소 때까지 전자 레인지에 살균 유리관에서 메티오닌이 부족 5ml 선택 미디어 0.06g 아가로 오스를 끓여.
3. 아가로 오스의 신속 피펫 200μl의 슬라이드 우울증 미디어가 포함된 기포가가 아래 갇힌되지 않도록해야 할, 그 위에 또 다른 깨끗한 유리 슬라이드를 반전.
4. 젤 굳은 때, 항상 평행들의 표면을 유지, 부드럽게 멀리 우울증 슬라이드의 상단에 슬라이드를 이동합니다. 이것은 아가로 오스 침대의 표면은 우울증 슬라이드의 표면을 잔뜩 것을 보장합니다. 섬세한 조직으로 아가로 오스 침대를 둘러싼 슬라이드 지역을 청소하십시오. 슬라이드는 이제 사용할 수 있습니다.
5. 당시 = 4 시간, 상온에서 5 분을 위해 2,200 rpm으로 원심 분리하여 살균 eppendorf 튜브와 수확의 문화 세포의 전송 1ml.
   참고 :이 나중에이 시간 연결되는 표현형 개발이 보장되도록 단백질 표현의 높은 수준을 보장하기 위해 선택할 수 권장합니다. 파일럿 실험 determin하는 데 필요한건별로 전자 유도 시간을.
6. 메티오닌 부족한 신선한 선택적 매체의 100μl에 뜨는 및 resuspend 세포를 대기음.
7. coverslip의 가장자리에 바셀린을 적용합니다. 다음 아가로 오스 침대의 중앙에 세포 현탁액의 드롭을 배치하고 부드럽게 그들을 통해 coverslip을 눌러 균일하게 확산.
8. 석유 젤리로 coverslip의 가장자리를 밀봉하고 매니큐어로 가장자리를 안감하여 위치를 수정. 매니큐어 증발 때까지 기다리십시오.
9. 현미경의 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하고 적절하게 간격 10 개 이상 세포를 포함하는 필드를 선택합니다. 세포 분열 때, 필드는 시간이 지남에 붐비는 얻을 것이다.
10. 필드의 이미지 ~ 5 시간 동안 5 분마다 가져가라. 표현형의 진행은 ImageJ 소프트웨어 (사용하는 동영상으로 이미지를 조립하여 연구 수 Rasband, WAS, ImageJ, 건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 년 미국 국립 연구소를 -2005 )

참고 : 우리는 자이스 혈구 Axiovert 200M 현미경을 사용하여 자이스 혈구 Axiocam MRM 디지털 카메라와 라이브 셀 이미징에 대한 칼 자이스 혈구 Axiovision 이미지 수집 소프트웨어 (버전 4.4) 단색. 온도 제어는 PeCon Tempcontrol 37 장치에 의해 30 ° C로 유지 열띤 무대에서 슬라이드를 삽입하여 이루어진다.

방지하기 위해 반복적으로 초점을 다시 조정, 자동으로 모든 시간 지점에서 몇 Z - 스택 이미지를 획득하고 영화를 조립하면 나중에 최고의 중점을두고 이미지를 선택할 수있는 이미지 수집 소프트웨어를 프로그램에 편리합니다. 일부 이미지 수집 소프트웨어는 시간 코스 실험 오토포커스의 옵션이 있습니다. 그것은 가능한 경우에 옵션을 사용하시면 편리합니다.

와일드 타입 효모 세포는 30에서 최고의 성장 ° C 따라서 온도 제어가 중요합니다. 적절한 열을 보장하기 위해서는 가열 단계 이외에 열을 외부 소스를 제공하는 도움이됩니다. 예를 들어, 우리는 이미지의 전체 기간 동안에 현미경의 전송 하얀 빛을 두십시오.

또한 아가로 오스의 침대와 세포 샌드위치를 ​​준비할 때 공기 방울을 피하기 위해 중요합니다. 거품 안에 갇힌 공기는 시간이 지남에 따라 가열하면 팽창 필드가 몇 군데되지 않도록 멀리 세포를 밀어 경향이 있습니다.

필드 내의 각 세포 위치를 확인하는 것도 중요 것은 특히 다시 초점을 시도하는 동안, 이미징 프로세스의 기간 동안 appreciably 변경하지 마십시오. 영화가 조립 후 ImageJ는 셀 위치에 작은 교대를 해결할 수 있도록 이미지 안정화 플러그인을 사용할 수 있습니다. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / 코드 / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

이 프로토콜은 단백질 overexpression시 형태학의 표현형 (적절한 세포 분열을 거쳐 수없는 효모 세포)의 개발을 모니터링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 빠른 속도 전지하고, 모호한 결과를 손상 수 있으므로 권장 원심 분리 속도 pelleting하여 효모 세포를 수확하기 위해 기억하는 것이 중요합니다. 메틸렌 블루와 Calcofluor 흰색들은 독성으로 직전 이미징에 세포를 사는에 추가되어 있어야합니다. 이 절차는 또한 쉽게 대상이 제어 모터의 표현 제공, 단백질 탄압 조건 하에서 관찰 phenotypes에 대해 적용할 수 있습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2