出芽酵母のタンパク質濃度の関数としての形態学的表現型の開発の分析

Summary

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する

Abstract

遺伝子欠失と蛋白質の過剰発現は、タンパク質の機能を研究するための一般的な方法です。この記事では、我々は、人口および単一細胞レベルでのタンパク質の濃度の関数として表現型の開発の分析のためのプロトコルを記述する

Protocol

A.細胞培養やタンパク質誘導

このセクションでは、酵母細胞内の調節可能なプロモーターからタンパク質の発現誘導に続いて細胞の培養条件、ノコダゾールによる細胞周期の同期を、説明します。

1. 野生型の酵母株W303（LEU2 - 3、112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11、15）の制御下に興味のある私たちの遺伝子を含む高コピー（2μ）プラスミドDNA（ENTH2）で形質転換されメチオニン抑制性プロモーター（MET25）の。メチオニン欠く培地では最大発現を可能にしながらメチオニン2mMのは、プロモーター活性を抑制するのに十分です。したがって、メチオニン濃度の範囲は、所望のレベルでタンパク質を発現するために使用することができます。 W303細胞におけるプラスミドDNAの1トランスフォーメーションは、標準の手順に従ってLiAc - TE法を用いて行われる^2。
   注：この実験は唯一のバックグラウンドレベルでのタンパク質発現を確保するためにメチオニン2mmの存在下で一晩細胞を増殖させることによって実行する必要があります。翌朝、蛋白質の発現は、メチオニン直後に細胞周期の同期（約4時間）を欠く培地で細胞を再懸濁することにより誘発されるべきである。しかし、我々は、すべての症状の分析のために時間のコースを作り、ENTH2依存性の細胞分裂の表現型が（通常、タンパク質の誘導³の4 - 6H後）ENTH2のかなりの濃度が細胞内に構築された後にのみ誘導されることを見出した（少なくとも16時間）が非常に長い表現。我々は、メチオニン0.2の存在下で一晩細胞を増殖する形態学的表現型を抑制するがメチオニン不足してメディアに転送するときに急速に表現型を誘発するレベルに高めることができる亜臨界タンパク濃度を可能にすることを見出した。これは時間の比較的短い期間での細胞分裂の欠陥の深刻な症状の詳細な分析を可能にします。我々は、それ故に、実験者は、ケースバイケースでの表現型の誘導のためのサブスレッシュホールドであるメチオニン濃度を決定することをお勧めします。
2. 標準的な滅菌技術を使用して滅菌コニカルフラスコ中のメチオニン0.2と選択培地の50mlに最近形質転換細胞と接種を含むプレートから六コロニーを選択してください。 30℃で一晩200 rpmで振とうしながらのCをインキュベートする。（標準的な酵母の培養条件の詳細については、文献4参照）
3. 翌朝、600nmの時の文化の光学密度を測定することにより見積もりの​​細胞密度。室温で5分間に2200 rpmで回転することによって滅菌遠心管と収穫に細胞の20 OD _600nmのに相当するものを転送する。
4. に再懸濁し、細胞は0.4 OD _600nmの / mlの濃度でYPDとDMSOの1mg/mlのストックからの15μg/mlの最終濃度にノコダゾールを追加。 200rpmで振盪しながら30℃で4時間インキュベートする。
   注：α- factorを使ってG0期でまたはヒドロキシウレアを使用してG1 - S期で停止を含む代替逮捕の方法を使用することができる。我々は、ノコダゾールを使用して有糸分裂で逮捕はシンプルで私たちの目的のために十分有効であることを見出した。
5. 4時間後、顕微鏡下に表示することによって、同じサイズの芽を持つ細胞の数をカウントすることによって有糸分裂で逮捕された細胞の割合を確認してください。逮捕が90％を超える場合は、以下の手順に進みます。有糸分裂停止の希望する割合が達成されるまでそれ以外の場合、ノコダゾールで細胞を維持する。
6. 5分2200 rpmで遠心分離によって細胞を回収し、氷冷水で3回洗浄する。最終洗浄後、〜0.5 OD _600nmの / mlの細胞密度でメチオニンを欠く選択培地でペレットを再懸濁します。新しい滅菌チューブに細胞の半分の量を転送し、最終的な0.2mmの濃度にメチオニン追加。これは、タンパク質発現の基底レベルによる影響のためのコントロールとして機能します。これは、実験の最初の時間ポイント（時間= 0H）をマークします。細胞を6時間毎時間を分析する。

表現型の開発のB.解析

注：以下で説明するすべての分析手法を同時に実行する必要はありません。

ウェスタンブロッティングによりタンパク質の発現レベルの決定

1. 毎回ポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離による細胞の培養と収穫2 OD _600nmの同等のOD _600nmのを測定_する 。
2. 1ミリリットル滅菌水でペレットを再懸濁し、1.5ミリリットルのエッペンドルフチュー​​ブに懸濁液を移す。ペレットを得るために遠心操作を繰り返します。上清を吸引除去する。
3. 50μlのSDS - PAGE Laemmliサンプル緩衝液（50mMトリスpH6.8で、2％SDS、10％グリセロール、2％β-メルカプトエタノールと0.006％ブロモフェノールブルー）でペレットを再懸濁する。酸洗浄ガラスビーズ（0.2から0.4ミクロンの直径）と1分間ボルテックス50μlのを追加。
4. 95℃熱BLO上でチューブを沸かし2分のためのCK、30秒のため、再度ボルテックスし、5分間煮沸再開。 -20℃でタンパク質試料を凍結
5. 、12％SDS - PAGEゲル上でタンパク質サンプルを実行するニトロセルロース膜に転写し、目的のタンパク質を検出するために適切な抗体を用いたウェスタンブロッティング行います。この例では、我々はBlotto中- Tweenでの1:2000希釈（1XPBS、5％脱脂粉乳でマウス抗HA抗体（Covance、プリンストン、NJ）でインキュベートすることにより、ENTHドメインをタグ付けヘマグルチニン（HA）の存在を探る、0.1％のTween）。またBlotto中 - トゥイーンで、1:2500の希釈でヤギ抗マウス二次抗体（Pierce）をタグ付きHRPは、室温で1時間のための膜に一次抗体を結合させています。 Supersignalウエストのピコ化学発光基質は、HRPタグ付けされた抗マウス抗体を検出するために使用されます。
6. デンシトメトリーによるタンパク質の発現レベルを定量化する。

このセクションでは、増加するタンパク質濃度の関数として追跡する表現型の開発の2つの方法について説明します。最初のメソッドは、単一細胞のレベルの第2の研究にしながら、細胞集団に基づいています。

細胞分裂の表現型と細胞死の定量化

1. 各タイムポイントで、5分に2200 rpmで遠心分離によって滅菌技術と収穫の細胞を用いて滅菌エッペンドルフチュー​​ブに1ミリリットルの細胞懸濁液を移す。
2. 上清を吸引除去し、滅菌水で1mg/mlのストックから、ブルー30μlのメチレンブルー続いて70μlのメディアでペレットを、懸濁します。メチレンブルーは、従って死んだ細胞は、その青い色で識別可能な細胞質ゾルの還元性環境で無色になる青生体染色色素である。
3. ピペット〜きれいなガラススライド上にこの懸濁液6μlとドロップを介してカバースリップを配置。ガラスのインターフェイス間で細胞の薄く均一な層を形成するために静かにカバースリップを押してください。
4. 9象限にカバースリップを分割し、図に示すように象限ごとに3の画像を取る。 2。細胞/フィールドの数は、正確な定量を可能にするために30セルよりも大きくすべきではありません。気泡が準備を損傷する前に、各カバースリップは、約15分間撮像することができます。
5. 研究対象の表現型を示す細胞の数を数えます。 ENTH2過剰発現により誘導される細胞分裂の欠陥は、細胞死につながる、それゆえ、我々はまた、青の色で識別される死細胞の数を数えます。
6. 表現型の細胞の割合を計算する。
7. 図に示すようにデータをプロットします。 3。

蛍光顕微鏡を用いて表現型固有の欠陥の可視化

としてENTH2過剰発現時に見られる細胞分裂欠陥のある細胞は、しばしば細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization3（GFP -融合タンパク質として可視化）によって特徴付けられる。出芽酵母の細胞壁は簡単に酵母細胞壁にキチンに不可逆的に結合するCalcofluorホワイト（CFW）での染色により可視化することができます。

1. 滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫細胞における文化のたびにポイント、アリコートの1ミリリットルで、室温で5分間2200 rpmで遠心分離によって。
2. 暗所で室温で5分間滅菌水とインキュベートで1mg/ml CFWソリューション液100μlに細胞ペレットを再懸濁します。
3. 遠心分離によって細胞を回収し、1X PBSで3回洗浄する。
4. 100Xの倍率で100μlの1X PBSでペレットとUV光学系を用いて顕微鏡下での画像（細胞壁）とFITCフィルター（GFP -セプチン）を再懸濁します。
5. セクションB.2.1で、次の手順4-6で細胞壁の欠陥とセプチンmislocalization持つ細胞の割合を定量化

B.3。タイムラプスビデオ顕微鏡：単一細胞レベルでの表現型の開発の決定。

1. 70％アルコールと凹面のうつ病とスライドガラスを清掃し、空気乾燥することができます。
2. アガロースが完全に溶けるまで電子レンジで滅菌ガラスチューブ内にメチオニンを欠く5ミリリットル選択培地で0.06グラムアガロースを煮る。
3. 迅速にピペットスライドうつ病のアガロース含有培地200μlのとそれ以上の別のきれいなガラススライドを反転させ、空気の泡が下敷きにされていないことを確認すること。
4. ゲルが固化するとき、常にその面が平行に保ち、スムーズに離れてうつ病のスライドから上にスライドを移動する。これは、アガロースの床の表面は、うつ病のスライドの表面と同じ高さであることを保証します。繊細な組織でアガロースのベッドを囲むスライド領域を清掃してください。スライドを使用する準備が整いました。
5. 時= 4時間、室温で5分間2200 rpmで遠心分離により培養液から滅菌エッペンドルフチュー​​ブと収穫へのセルの転送1ミリリットル。
   注：これは、その表現型の開発が保証されているので、時間の点後は、タンパク質発現の高いレベルを確保するために選択することをお勧めします。パイロット実験を決定する際に必要です。ケースバイケースで、電子誘導時間を。
6. メチオニン不足して新鮮な選択培地100μlの上清と再懸細胞を吸引除去する。
7. カバースリップの端にワセリンを塗布。その後、アガロースのベッドの中心に細胞懸濁液のドロップを配置し、静かにその上にカバースリップを押すことによって一様に広がる。
8. ワセリンでカバースリップの端をシールし、マニキュアでのエッジの内側を覆うことによって、その位置を固定。マニキュアが乾くまで待ちます。
9. 顕微鏡の加熱ステージ上でスライドを配置し、十分な間隔10以上のセルを含むフィールドを選択してください。細胞が分裂するように、フィールドは、時間の経過とともに混雑してしまいます。
10. フィールドの画像〜5時間、5分ごとにかかります。表現型の進行は、ImageJのソフトウェアを（使ってムービーに画像を組み立てることで調べることができますRasband、WS、ImageJは、保健、ベセスダ、メリーランド州、アメリカ、http://rsb.info.nih.gov/ij/、1997年の米国国立研究所-2005 ）

注：我々はツァイスAxiovert 200M顕微鏡を使用して、ツァイスAxiocam MRMは、デジタルカメラと生細胞イメージングのためのカールツァイスAxioVisionの画像収集ソフトウエア（バージョン4.4）モノクロ。温度制御は、PeCon Tempcontrol 37デバイスで30℃に維持加熱ステージ上でスライドを配置することによって達成されます。

繰り返しフォーカスを再調整を避けるために、それは自動的にすべての時間の時点でいくつかのZスタック画像を取得し、ムービーを組み立てる際、後で最良の焦点で画像を選択する画像取得ソフトウエアをプログラムするのに便利です。いくつかの画像取得ソフトは、時間経過実験のためのオートフォーカスのオプションがあります。それはときに利用でそのオプションを使用すると便利です。

野生型酵母細胞は、30で最高の成長° Cしたがって、温度制御が重要です。十分な熱を確保するためには、加熱された段階に加えて、熱の外部ソースを提供するために便利です。例えば、我々は、イメージングの全期間に顕微鏡の透過白色光のまま。

また、アガロースのベッドと細胞のサンドイッチを準備する際に気泡を避けるために重要です。気泡内に閉じ込められた空気は、時間をかけて加熱すると膨張し、離れて撮像されてフィールドから細胞をプッシュする傾向がある。

それは、特に再フォーカスの試行中に、そのフィールド内の各セルの位置が画像のプロセスの期間にわたってかなり変更されないようにすることも重要です。映画を組付けた後、ImageJはセルの位置に小さなシフトを是正するための画像安定化プラグインが用意されています。 （ http://www.cs.cmu.edu/〜伉儷/コード/ Image_Stabilizer.html ）。

Discussion

このプロトコルは、タンパク質の過剰発現時に形態学的表現型（適切な細胞分裂を受けることができない酵母細胞）の開発を監視する方法について説明します。この手順を行うときは、それより速いスピードで細胞や不明瞭な結果を傷める可能性がありますので、推奨遠心速度で沈殿させ、酵母細胞を採取することを忘れないことが重要です。メチレンブルーとCalcofluor白は、それらが有毒であるとしてちょうどイメージングの前に細胞を生きるに追加する必要があります。この手順は、簡単にターゲットを制御可能なプロモーターから発現される提供、蛋白質の抑制の条件下で観察表現型に適合させることができる。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2