Analisi dello sviluppo di un fenotipo morfologico come funzione della concentrazione di proteine ​​in lievito

Summary

Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli

Abstract

Delezione del gene e l'iperespressione delle proteine ​​sono metodi comuni per lo studio delle funzioni delle proteine. In questo articolo, descriviamo un protocollo per l'analisi del fenotipo di sviluppo in funzione della concentrazione di proteine ​​a popolazione e monocellulari livelli

Protocol

A. coltura cellulare e induzione di proteine

Questa sezione descrive le condizioni di coltura cellulare, ciclo cellulare sincronizzazione con Nocodazole, seguita da induzione di espressione della proteina da un promotore regolabile in cellule di lievito.

1. Il selvaggio lievito ceppo del tipo W303 (leu2-3, 112 TRP1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) si trasforma con copia alto (2μ) DNA plasmide che contiene il nostro gene di interesse (ENTH2) sotto il controllo di metionina-reprimibile promotore (MET25). Metionina 2mM è sufficiente per sopprimere l'attività promotore, mentre i media manca metionina permette l'espressione massima. Quindi, una gamma di concentrazioni di metionina può essere utilizzato per esprimere la proteina al livello desiderato. 1 Trasformazione di DNA plasmidico in cellule W303 viene fatto usando il LIAC-TE metodo secondo le procedure standard ^2.
   Nota: Questo esperimento deve essere eseguita da crescere le cellule durante la notte, in presenza di 2mM metionina per garantire l'espressione della proteina solo a livelli di fondo. La mattina dopo, espressione di proteine ​​deve essere indotta da risospendere le cellule in mancanza di mezzi di metionina subito dopo la sincronizzazione del ciclo cellulare (circa 4h). Tuttavia, abbiamo scoperto che il ENTH2-dipendente fenotipo divisione cellulare è indotta solo dopo una notevole concentrazione di ENTH2 ha accumulato nelle cellule (in genere dopo 4-6h di induzione di proteine ^​​3), rendendo l'andamento temporale per l'analisi di tutte le manifestazioni di il fenotipo molto lungo (almeno 16h). Abbiamo scoperto che le cellule in crescita durante la notte, in presenza di metionina 0.2mm reprime il fenotipo morfologico, ma permette di concentrarsi subcritico proteina che può essere rapidamente aumentato a fenotipo che inducono i livelli quando vengono trasferiti su supporti privi metionina. Ciò consente un'analisi dettagliata di gravi manifestazioni del difetto divisione cellulare in un periodo relativamente breve di tempo. Noi consigliamo quindi che lo sperimentatore determinare la concentrazione di metionina che è sotto-soglia per l'induzione fenotipo caso per caso.
2. Scegliete sei colonie da un piatto contenente cellule recentemente trasformata e inoculare in 50 ml di terreni selettivi con 0.2mm metionina in un pallone sterilizzato conica utilizzando le normali tecniche sterili. Incubare per una notte a 30 ° C con agitazione a 200 giri al minuto. (Per ulteriori informazioni sulle condizioni standard di coltura di lievito, vedi rif. 4)
3. La mattina seguente, la densità delle cellule stimare misurando la densità ottica della cultura a 600nm. Trasferire l'equivalente di 20 OD _600nm di cellule in una provetta sterile e raccogliere facendo girare a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
4. Risospendere le cellule in YPD ad una concentrazione di 0,4 OD _600nm / ml e aggiungere Nocodazole ad una concentrazione finale di 15μg/ml di da uno stock di 1mg/ml in DMSO. Incubare per 4 ore a 30 ° C con agitazione a 200gpm.
   Nota: i metodi alternativi di arresti tra cui l'arresto in fase G0 con alfa-factor o in fase G1-S con idrossiurea può essere utilizzato. Abbiamo scoperto che l'arresto in mitosi usando Nocodazole è semplice e abbastanza efficace per i nostri scopi.
5. Dopo 4 ore, controllare la percentuale di cellule in mitosi arrestati contando il numero di celle con dimensioni pari gemme osservando al microscopio. Se l'arresto è superiore al 90%, passare alla fase successiva. In caso contrario, mantenere le cellule nel Nocodazole fino a quando la percentuale desiderata di arresto mitotico è raggiunto.
6. Celle di raccolta per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti e lavare con acqua ghiacciata per tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in terreni selettivi mancano metionina ad una densità cellulare di circa 0,5 OD _600nm / ml. Trasferire la metà del volume delle cellule in una nuova provetta sterile e aggiungere metionina ad una concentrazione finale di 0,2 mm. Questo servirà come un controllo per gli effetti a causa di livelli basali di espressione della proteina. Questo segna la prima volta, punto dell'esperimento (tempo = 0h). Analizzare le cellule ogni ora per 6 ore.

B. Analisi dello Sviluppo Fenotipo

Nota: Tutti i metodi di analisi descritti di seguito non devono essere eseguite simultaneamente.

Determinazione dei livelli di espressione della proteina mediante Western blotting

1. Ad ogni time-point, misurare la OD _600nm della cultura e del raccolto 2 OD _600nm equivalenti di cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti.
2. Risospendere il pellet in 1 ml di acqua sterile e trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 ml Eppendorf. Ripetere la centrifugazione per ottenere un pellet. Aspirare il sopranatante.
3. Risospendere il pellet in 50μl SDS-PAGE tampone campione Laemmli (50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolo, 2% β-mercaptoetanolo e 0,006% bromofenolo blu). Aggiungere 50μl di lavata con acido perle di vetro (0.2-0.4 micron di diametro) e vortex per 1 min.
4. Tubi bollire a 95 ° C di calore block per 2 minuti, vortice di nuovo per 30 secondi e di riprendere la bollitura per 5 minuti. Congelare il campione a -20 ° C.
5. Esegui campioni di proteine ​​su un 12% SDS-PAGE gel, trasferimento su una membrana di nitrocellulosa ed eseguire Western blotting con anticorpi idonei a rilevare la proteina di interesse. In questo esempio, si sonda la presenza di emoagglutinina (HA) tagged domini settimo incubando con il mouse anticorpi anti-HA (Covance, Princeton, NJ) a 1:2000 diluizione in Blotto-Tween (1XPBS, 5% senza grassi del latte secco , 0,1% Tween). HRP tag capra anti-topo anticorpo secondario (Pierce) a una diluizione di 1:2500, anche in Blotto-Tween, è consentito di legare l'anticorpo primario sulla membrana per 1 ora a temperatura ambiente. Supersignal substrato Pico Occidente chemiluminescenza viene utilizzato per rilevare HRP anticorpo murino anti tag.
6. Quantificare i livelli di espressione della proteina di densitometria.

Questa sezione descrive due metodi di sviluppo fenotipo monitoraggio in funzione della concentrazione di proteine ​​in aumento. Il primo metodo è la cellula-base della popolazione, mentre gli studi di secondo, a livello di una singola cella.

Quantificazione di cellule fenotipo-divisione e morte cellulare

1. Ad ogni time-point, trasferimento di sospensione 1 ml di cellule in una provetta sterile eppendorf utilizzando tecniche sterili e raccogliere le cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti.
2. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 70μl media, seguita dalla blu di metilene 30μl da uno stock di 1mg/ml in acqua sterile. Blu di metilene è un colorante blu vitale che diventa incolore in ambiente riducente del citosol quindi le cellule morte possono essere identificati dal loro colore blu.
3. Pipettare ~ 6μl di questa sospensione su un vetrino pulito e mettere un coprioggetto sopra la goccia. Premere il coprioggetto delicatamente a formare uno strato sottile e uniforme di cellule tra le interfacce di vetro.
4. Dividere il coprioggetto in 9 quadranti e prendere 3 immagini al quadrante come indicato in fig. 2. Il numero di cellule / campo deve essere non più grandi di 30 celle per consentire una quantificazione precisa. Ogni vetrino possono essere esposte per circa 15 minuti prima di bolle d'aria danneggiare la preparazione.
5. Contare il numero di cellule che mostrano il fenotipo in fase di studio. Il difetto divisione cellulare indotta su ENTH2 sovraespressione porta alla morte cellulare e, di conseguenza, abbiamo anche contare il numero di cellule morte identificati dal loro colore blu.
6. Calcolare la percentuale di cellule fenotipo.
7. Tracciare i dati come mostrato in fig. 3.

Visualizzazione di fenotipo-specifici difetti usando la microscopia a fluorescenza

Divisione cellulare delle cellule difettose, come si è visto su ENTH2 iperespressione, sono spesso caratterizzate da difetti della parete cellulare e Septin mislocalization3 (visualizzato come GFP-fusione di proteine). La parete cellulare del lievito può essere facilmente visibili con la colorazione Calcofluor Bianco (CFW) che si lega in maniera irreversibile alla chitina nelle pareti delle cellule di lievito.

1. Ad ogni time-point, 1ml aliquota della cultura in un tubo eppendorf sterile e raccogliere le cellule per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Risospendere il pellet cellulare in 100μl di 1mg/ml soluzione CFW in acqua sterile e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
3. Celle di raccolta per centrifugazione e lavare 3 volte con PBS 1X.
4. Risospendere il pellet in 100μl di PBS 1X e l'immagine al microscopio utilizzando ottiche UV (parete cellulare) e di filtri FITC (GFP-Septin) con ingrandimento 100X.
5. Quantificare la percentuale di cellule con difetti della parete cellulare e mislocalization Septin seguendo i passaggi 4-6 nella sezione B.2.1

B.3. Determinazione del fenotipo di sviluppo a livello di singola cellula: Time-lapse microscopia video.

1. Pulire un vetrino con una depressione concava con il 70% di alcol e lasciare asciugare all'aria.
2. Lessate 0,06 g di agarosio in 5ml terreni selettivi mancano metionina in un tubo di vetro sterile in un forno a microonde fino a quando l'agarosio si scioglie completamente.
3. Rapidamente 200μl pipetta della agarosio contenente i media nella depressione diapositive e invertire un altro vetrino pulito di vetro su di esso, facendo attenzione che non bolle d'aria intrappolate sotto.
4. Quando il gel si solidifica, spostare la diapositiva in cima senza problemi di distanza dalla diapositiva depressione, mantenendo le loro superfici parallele in ogni momento. Questo assicura che la superficie del letto di agarosio è a filo con la superficie del vetrino depressione. Pulire la regione scivolo che circonda il letto di agarosio con un tessuto delicato. Il vetrino è pronto per l'uso.
5. Al tempo = 4 ore, 1 ml trasferimento di cellule dalla cultura in una provetta eppendorf sterile e la raccolta per centrifugazione a 2200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
   Nota: Si consiglia un secondo tempo punto di essere scelto per assicurare alti livelli di espressione della proteina in modo che lo sviluppo del fenotipo è garantita. Esperimenti pilota sono tenuti al determine tempi di induzione caso per caso.
6. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100μl di fresco terreni selettivi mancano metionina.
7. Applicare vaselina ai bordi del coprioggetto. Poi mettete una goccia di sospensione cellulare al centro del letto di agarosio e diffusa uniformemente premendo delicatamente un coprioggetto su di loro.
8. Sigillare i bordi del coprioggetto con vaselina e fissare la sua posizione, allineando i bordi con smalto. Attendere che la asciuga smalto.
9. Posizionare il vetrino su un palco riscaldato di un microscopio e scegliere un campo che contiene non più di 10 cellule distanziate in modo adeguato. Come le cellule si dividono, il campo affollato nel tempo.
10. Prendete l'immagine del campo ogni 5 minuti per ~ 5 ore. Progressione del fenotipo possono essere studiati con l'assemblaggio di immagini in un filmato utilizzando il software ImageJ ( Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Nota: utilizzare microscopio Zeiss Axiovert 200M, Zeiss AxioCam MRM monocromatica fotocamera digitale e Carl Zeiss software di acquisizione immagini AxioVision (versione 4.4) per l'imaging cellulare dal vivo. Il controllo della temperatura si ottiene mettendo diapositive su un palco riscaldato mantenuta a 30 ° C, secondo il Tempcontrol Pecon 37 dispositivo.

Al fine di evitare ri-regolazione la messa a fuoco più volte, è conveniente per programmare il software di acquisizione immagini per acquisire automaticamente un paio di Z-Stack immagini a ogni time-point e scegliere l'immagine con la migliore messa a fuoco più tardi, quando il montaggio del film. Alcuni software di acquisizione immagini hanno la possibilità di messa a fuoco automatica per gli esperimenti corso del tempo. E 'conveniente usare l'opzione a quando disponibili.

Selvatico cellule di lievito tipo crescono meglio a 30 ° C quindi il controllo della temperatura è un fattore critico. Al fine di garantire un adeguato riscaldamento, è utile per fornire una fonte esterna di calore, oltre alla fase di riscaldamento. Per esempio, lasciare la luce trasmessa bianca del microscopio per tutta la durata delle immagini.

E 'anche fondamentale per evitare bolle d'aria durante la preparazione del letto di agarosio e panino cellulare. L'aria intrappolate nelle bolle si espande quando riscaldato nel tempo e tendono a spingere le cellule lontano dal campo di essere fotografato.

E 'inoltre importante garantire che le posizioni delle singole celle all'interno del campo non cambiano sensibilmente per tutta la durata del processo di imaging, in particolare durante rifocalizzazione tentativi. Plugin di stabilizzazione delle immagini sono disponibili per ImageJ per correggere piccoli spostamenti nella posizione di cella dopo il film è stato assemblato. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Questo protocollo descrive come monitorare lo sviluppo di un fenotipo morfologico (cellula di lievito in grado di sottoporsi corretta divisione cellulare) al momento della sovraespressione proteica. Nel fare questa procedura è importante ricordarsi di raccogliere le cellule di lievito da pellettatura alla velocità di centrifugazione raccomandata come velocità più elevate possono danneggiare le cellule ed i risultati oscuri. Blu di metilene e Calcofluor bianco deve essere aggiunto a vivere le cellule appena prima di imaging come sono tossici. Questa procedura può anche essere facilmente adattato per fenotipi osservati in condizioni di repressione delle proteine, a condizione che l'obiettivo è espresso da un promotore controllabile.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2