Analys av utveckling av en morfologisk Fenotyp som en funktion av proteinkoncentration i Budding Jäst

Summary

Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i

Abstract

Gendeletion och protein överuttryck är vanliga metoder för att studera funktionen av proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för analys av fenotyp utveckling som en funktion av protein koncentration på befolkning och encelliga nivåer i

Protocol

A. cellkultur och Protein Induktion

Detta avsnitt beskriver förutsättningarna cellodling, cell-cykel synkronisering med Nocodazole, följt av induktion av protein uttryck från en som kan ställas promotor i jästceller.

1. Den vilda typen jäst stam W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) omvandlas med hög kopia (2μ) plasmid-DNA som innehåller vår genen av intresse (ENTH2) under kontroll av metionin-repressible promotor (MET25). 2mm metionin är tillräckligt för att undertrycka promotor aktivitet, samtidigt som media saknar metionin tillåter maximalt uttryck. Därför kan en rad metionin koncentrationer användas för att uttrycka det protein på önskad nivå. 1 Omvandling av plasmid-DNA i W303 celler görs med LiAc-TE metoden enligt gällande rutiner. ²
   Notera: Detta experiment bör utföras av växande celler natten i närvaro av 2mm metionin att säkerställa proteinuttryck endast vid bakgrundsnivåerna. Nästa morgon, bör protein uttryck sättas igång med resuspending cellerna i medierna saknar metionin omedelbart efter cell-cykel synkronisering (ca 4 tim). Vi har dock funnit att ENTH2 beroende celldelning fenotyp induceras först efter en avsevärd koncentration av ENTH2 har byggt upp i cellerna (vanligen efter 4-6h av protein induktion ^3), vilket gör den tid kursen för analys av alla former av fenotypen mycket långa (minst 16h). Vi har funnit att växa cellerna natten i närvaro av 0,2 mm metionin undertrycker den morfologiska fenotypen men tillåter underkritiska proteinkoncentration som snabbt kan ökas till fenotyp-inducerande nivåer när överföras till media saknas metionin. Detta möjliggör detaljerad analys av allvarliga manifestationer av celldelning fel i en relativt kortare period. Vi rekommenderar därför att försöksledaren bestämma metionin koncentration som är under gränsvärdena för fenotyp induktion från fall till fall.
2. Välj sex kolonier från en skylt som innehåller nyligen förvandlats celler och inokulera i 50 ml selektiva medier med 0.2mm metionin i en steriliserad kolv med hjälp av vanliga sterila tekniker. Inkubera över natten vid 30 ° C med skakning vid 200 rpm. (För mer information om standardvillkor jästkultur, se ref. 4)
3. Nästa morgon, uppskattning celltäthet genom att mäta den optiska densiteten för kulturen på 600 Nm. Överför motsvarar 20 OD _{600 Nm} av celler i ett sterilt centrifugrör och skörd genom att snurra vid 2200 rpm i 5 min vid rumstemperatur.
4. Resuspendera cellerna i YPD vid en koncentration av 0,4 OD _{600 Nm} / ml och tillsätt Nocodazole till en slutlig koncentration av 15μg/ml av från ett lager av 1mg/ml i DMSO. Inkubera i 4h vid 30 ° C med skakningar vid 200rpm.
   Obs: Alternativa arrestera metoder inklusive gripa vid G0 fasen med hjälp av alpha-faktor eller på G1-S-fasen med hydroxiurea kan användas. Vi har funnit att gripandet vid mitos använda Nocodazole är enkel och effektiv nog för våra syften.
5. Efter 4 timmar, kolla procentandel av cellerna som greps i mitosen genom att räkna antalet celler med lika stora knoppar genom att titta i mikroskop. Om gripandet är större än 90%, fortsätta med följande steg. Annars upprätthålla celler i Nocodazole tills önskad andel av mitotiska arrestering uppnås.
6. Harvest cellerna genom centrifugering vid 2200 rpm för 5min och tvätta med iskallt vatten tre gånger. Efter den sista tvätten, Återsuspendera pelleten i selektiva medier saknar metionin i en cell densitet på ~ 0,5 OD _{600 Nm} / ml. Överför halv volymen av celler till ett nytt sterilt rör och lägga till metionin till en slutlig 0.2mm koncentration. Detta kommer att fungera som en kontroll för effekter på grund av basala nivåer av protein uttryck. Detta är första gången-punkt för försöket (tid = 0h). Analysera cellerna varje timme för 6h.

B. Analys av Fenotyp utveckling

Notera: Alla de analysmetoder som beskrivs nedan inte behöver utföras samtidigt.

Fastställande av nivåer proteinuttryck av Western blotting

1. Vid varje tid-punkt, mäta OD _600Nm av kulturen och skörd 2 OD _600Nm medel av celler genom centrifugering vid 2200 rpm i 5 minuter.
2. Återsuspendera pelleten i 1 ml sterilt vatten och överför suspensionen till ett 1,5 ml Eppendorf-rör. Upprepa centrifugering för att få en pellet. Aspirera supernatanten.
3. Återsuspendera pelleten i 50μl SDS-PAGE laemmli prov buffert (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 2% β-merkaptoetanol och 0,006% Bromfenolblått). Tillsätt 50μl av syratvättad glaspärlor (från 0,2 till 0,4 mikrometer i diameter) och skaka i 1 min.
4. Koka rören på ett 95 ° C värme block för 2 minuter, virvel igen för 30 sekunder och fortsätt kokningen i 5 min. Frysa protein provet vid -20 ° C.
5. Kör protein prover på en 12% SDS-PAGE gel, överföring till en nitrocellulosa membran och utföra Western blotting med lämpliga antikroppar för påvisande av proteinet av intresse. I detta exempel sond vi förekomsten av hemagglutinin (HA) taggade ENTH domäner genom inkubering med mus anti-HA (Covance, Princeton, NJ) på 1:2000 spädning i ASFULL-Tween (1XPBS, 5% fettfri torrmjölk , 0,1% Tween). HRP taggade get-anti-mus sekundär antikropp (Pierce) vid en utspädning av 1:2500, även i ASFULL-Tween, är tillåtet att binda den primära antikroppen på membran för 1h i rumstemperatur. Supersignal West Pico Kemiluminiscent underlag används för att upptäcka HRP taggad anti mus antikropp.
6. Kvantifiera proteinnivåer uttryck genom densitometri.

Detta avsnitt beskriver två metoder för att spåra fenotyp utveckling som en funktion av ökad protein koncentration. Den första metoden är cell-populationsbaserade, medan den andra studier på samma nivå som en enda cell.

Kvantifiering av cell-delning fenotyp och celldöd

1. Vid varje tid-punkten, överför 1 ml cellsuspension till en steril Eppendorf-rör med sterila tekniker och celler skörd genom centrifugering vid 2200 rpm i 5 minuter.
2. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 70μl media, följt av 30μl Metylenblått från ett lager av 1mg/ml i sterilt vatten. Metylenblått är en blå viktigt färgämne som blir färglös i reducerande miljö i cytosolen därmed döda celler kan identifieras genom sin blå färg.
3. Pipettera ~ 6μl från det tillfälliga upphävandet på ett rent objektglas och lägg på ett täckglas över droppe. Tryck på täckglas försiktigt för att bilda ett tunt, jämnt lager av celler mellan glaset gränssnitt.
4. Dela täckglas i 9 kvadranter och ta 3 bilder per kvadrant som anges i figur. 2. Antalet celler / område bör inte vara större än 30 celler för att ge exakt kvantifiering. Varje täckglas kan avbildas i ca 15 minuter innan luftbubblor skador beredningen.
5. Räkna antalet celler som visar fenotypen under utredning. Den celldelning defekten framkallas på ENTH2 överuttryck leder till celldöd och därmed vi också räkna antalet döda celler identifieras av deras blå färg.
6. Beräkna andelen fenotypiska celler.
7. Plotta data som visas i figur. 3.

Visualisering av fenotyp-specifika fel genom att använda fluorescensmikroskopi

Cell-divisionen defekta celler, vilket kan ses på ENTH2 överuttryck, präglas ofta av cellvägg fel och septin mislocalization3 (visualiseras som GFP-fusionsproteiner). Cellväggen av spirande jäst kan enkelt visualiseras genom färgning med Calcofluor Vit (CFW) som binder irreversibelt till kitin i väggar jäst cell.

1. Vid varje tid-punkt, delprov 1 ml av kulturen i ett sterilt Eppendorf-rör och celler skörd genom centrifugering vid 2200 rpm i 5 minuter vid rumstemperatur.
2. Resuspendera cellpelleten i 100μl av 1mg/ml CFW lösning i sterilt vatten och inkubera 5 minuter vid rumstemperatur i mörker.
3. Harvest celler genom centrifugering och tvätta tre gånger med 1X PBS.
4. Återsuspendera pelleten i 100μl 1X PBS och bild under mikroskop med hjälp av UV-optik (cellvägg) och FITC-filter (GFP-septin) vid 100X förstoring.
5. Kvantifiera andelen celler med cellväggar fel och septin mislocalization genom att följa stegen 4-6 i avsnitt B.2.1

B.3. Fastställande av fenotyp utveckling på en enda cell nivå: Time-lapse video mikroskopi.

1. Rengör en glasskiva med en konkav depression med 70% alkohol och låt lufttorka.
2. Koka 0.06g agaros i 5ml selektiva medier saknar metionin i ett sterilt glasrör i mikrovågsugn tills agarosen löser sig helt.
3. Snabbt pipett 200μl av agaros som innehåller media i bilden depression och invertera annan ren glasskiva över den, se till att inga luftbubblor fastnar under.
4. När gelen stelnar, flyttar du på toppen smidigt bort från depression bilden, hålla deras ytor parallellt hela tiden. Detta säkerställer att ytan på agarosen sängen är jäms med ytan av depression bilden. Rengör bilden regionen kring agaros sängen med en delikat vävnad. Bilden är nu klar för användning.
5. Vid tiden = 4 timmar, överföring 1ml av celler från kultur till ett sterilt Eppendorf-rör och skörd genom centrifugering vid 2200 rpm i 5 minuter vid rumstemperatur.
   OBS: Det rekommenderas en senare tid-punkten väljas för att garantera höga nivåer av proteinuttryck så att fenotypen utveckling garanteras. Pilotförsök måste fastställbarae induktion gånger från fall till fall.
6. Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 100μl av färska selektiva medier saknas metionin.
7. Applicera vaselin på kanterna av täckglas. Placera därefter en droppe cellsuspensionen i centrum av agarosen sängen och fördelas jämnt genom att försiktigt trycka på ett täckglas över dem.
8. Täta kanterna på täckglas med vaselin och fixa sin position genom att klä kanterna med nagellack. Vänta tills nagellacket torkar.
9. Placera bilden på en uppvärmd skede av ett mikroskop och välja ett fält som innehåller inte mer än 10 celler fördelade på lämpligt sätt. Som celler delar kommer fältet bli trångt med tiden.
10. Ta en bild av fältet var 5 minuter för ~ 5 timmar. Fenotyp progression kan studeras genom att samla bilderna till en film med ImageJ programvara ( Rasband, var ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Observera: Vi använder Zeiss Axiovert 200M mikroskop, monokrom Zeiss AxioCam MRM digitalkamera och Carl Zeiss AxioVision Image Acquisition (version 4,4) för levande cell imaging. Temperatur kontroll uppnås genom att placera bilderna på en uppvärmd scenen hålls vid 30 ° C enligt PeCon Tempcontrol 37 enhet.

För att undvika att åter justera fokus upprepade gånger, är det lämpligt att programmet programvaran bilden förvärvet för att automatiskt få ett par z-stack bilder vid varje tid-punkt och välja den bild med bäst fokus senare vid montering av film. Vissa bildtagning mjukvaran har möjlighet att autofokus för experiment halvfart. Det är bekvämt att använda det alternativet i när det finns.

Vildtyp jästceller växer bäst vid 30 ° C därför temperaturreglering är kritisk. För att säkerställa tillräcklig värme, är det bra att ge en extern värmekälla utöver den uppvärmda scenen. Till exempel, lämnar vi den utsända vitt ljus från mikroskop på för hela den tid avbildning.

Det är också avgörande för att undvika luftbubblor när de upprättat agarosen sängen och cell smörgås. Luften anhållna i bubblor expanderar vid uppvärmning över tid och tenderar att driva celler bort från fältet som avbildas.

Det är också viktigt att se till att enskilda cellen positioner inom området förändras inte nämnvärt under hela avbildningsprocessen, särskilt under ny inriktning på försök. Bildstabilisering plugins finns för ImageJ att korrigera små förändringar i cellens position efter att filmen har monterats. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Detta protokoll beskriver hur du följa utvecklingen av en morfologisk fenotyp (jäst cell kan genomgå ordentlig celldelning) vid protein överuttryck. När du gör detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att skörda jästceller genom pelletering i rekommenderad centrifugeringsvarvtal som högre hastigheter kan skada celler och oklara resultat. Metylenblått och Calcofluor vita bör läggas till levande celler strax före avbildning som de är giftiga. Detta förfarande kan också lätt anpassas för fenotyper observerade under villkor protein förtryck, förutsatt att målet är uttryckt i en kontrollerbar promotor.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2