Analyse du développement d'un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Summary

Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans

Abstract

Délétion du gène et surexpression de la protéine sont des méthodes courantes pour l'étude des fonctions des protéines. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour l'analyse du développement phénotype en fonction de la concentration de protéines au niveau de la population et une seule cellule dans

Protocol

Culture cellulaire et d'induction des protéines A.

Cette section décrit les conditions de culture cellulaire, cycle cellulaire synchronisation avec Nocodazole, suivie par l'induction de l'expression de la protéine à partir d'un promoteur régulable dans des cellules de levure.

1. La souche de type sauvage de levure W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) est transformé avec de copies (2μ) ADN plasmidique qui contient notre gène d'intérêt (ENTH2) sous le contrôle d'un promoteur répressible par la méthionine (MET25). 2 mM de méthionine est suffisante pour supprimer l'activité du promoteur, tandis que des milieux sans méthionine permet une expression maximale. Par conséquent, une gamme de concentrations de méthionine peut être utilisé pour exprimer la protéine au niveau désiré. 1 Transformation d'ADN plasmidique dans les cellules W303 est fait en utilisant la méthode LiAc-TE selon les procédures standard ^2.
   Remarque: Cette expérience doit être réalisée par culture des cellules pendant la nuit, en présence de 2 mM de moithionine pour assurer l'expression des protéines seulement à des niveaux de fond. Le lendemain matin, l'expression de protéines devrait être induite par remise en suspension des cellules dans des milieux dépourvus de méthionine immédiatement après la synchronisation du cycle cellulaire (environ 4h). Cependant, nous avons constaté que le phénotype cellulaire dépendante ENTH2 division est induite qu'après une forte concentration de ENTH2 s'est accumulée dans les cellules (en général après 4-6h de ³ induction de protéines), ce qui rend le cours du temps pour l'analyse de toutes les manifestations de le phénotype très longue (au moins 16h). Nous avons constaté que la croissance des cellules au jour le jour, en présence de 0,2 mM de méthionine réprime le phénotype morphologique mais permet la concentration de protéines sous-critique qui peut être augmentée rapidement au phénotype induisant des niveaux lorsqu'ils sont transférés à des milieux sans méthionine. Cela permet une analyse détaillée des manifestations graves de la défectuosité de la division cellulaire dans une période relativement courte de temps. Nous recommandons par conséquent que la détermi expérimentateure la concentration de méthionine qui est sous-seuil pour l'induction phénotype au cas par cas.
2. Choisissez six colonies partir d'une plaque contenant des cellules transformées récemment et l'inoculer dans 50 ml de milieu sélectif avec la méthionine 0,2 mM dans une fiole conique stérilisé en utilisant des techniques stériles. Incuber une nuit à 30 ° C avec agitation à 200 rpm. (Pour plus d'informations sur les conditions standard de culture de levures, voir réf. 4)
3. Le lendemain matin, estimation de la densité cellulaire en mesurant la densité optique de la culture à 600 nm. Transférer l'équivalent de 20 _{600 nm} DO de cellules dans un tube de centrifugation stériles et récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante.
4. Resuspendre les cellules dans YPD à une concentration de 0,4 DO _{600 nm} / ml et ajouter Nocodazole à une concentration finale de 15μg/ml d'un stock de 1mg/ml dans du DMSO. Incuber pendant 4h à 30 ° C sous agitation à 200rpm.
   Méthodes alternatives, y compris un arrêt: Noterrest à la phase G0 à l'aide du facteur alpha ou en phase de G1-S en utilisant l'hydroxyurée peut être utilisé. Nous avons trouvé que l'arrestation lors de la mitose en utilisant Nocodazole est simple et assez efficace pour nos besoins.
5. Après 4h, vérifiez pourcentage de cellules en mitose arrêtés en comptant le nombre de cellules avec des bourgeons de taille égale en regardant au microscope. Si l'arrestation est supérieur à 90%, passez à l'étape suivante. Sinon, maintenir les cellules dans Nocodazole jusqu'à ce que le pourcentage désiré de arrêt de la mitose est atteint.
6. Récolte des cellules par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes et laver avec de l'eau glacée à trois reprises. Après le lavage final, les resuspendre dans des milieux sélectifs manquent de méthionine à une densité cellulaire d'environ _{600 nm} 0,5 DO / ml. Transférer la moitié du volume de cellules dans un nouveau tube stérile et ajouter la méthionine à une concentration finale de 0,2 mM. Cela permet un contrôle des effets dus aux niveaux de base de l'expression des protéines. Il s'agit de la première fois, le point de l'expérience (time = 0h). Analyser les cellules toutes les heures pendant 6h.

B. Analyse du développement Phénotype

Remarque: Toutes les méthodes d'analyse décrites ci-dessous n'ont pas besoin d'être exécutées simultanément.

Détermination des niveaux d'expression des protéines par western blot

1. A chaque point dans le temps, mesurer l'OD _{600 nm} de la culture et de la récolte 2 DO _600nm équivalents de cellules par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes.
2. Reprendre le culot dans 1 ml d'eau stérile et transférer la suspension dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. Répétez la centrifugation pour obtenir un culot. Aspirer le surnageant.
3. Reprendre le culot dans 50 pl de SDS-PAGE tampon échantillon de Laemmli (Tris 50 mM pH 6,8, SDS 2%, glycérol 10%, β 2%-mercaptoéthanol et 0,006% bleu de bromophénol). Ajouter 50 ul de billes de verre lavées à l'acide (0.2-0.4 microns de diamètre) et vortex pendant 1 min.
4. Faire bouillir les tubes sur un 95 ° C blo chaleurck pendant 2 minutes, tourbillon à nouveau pendant 30 secondes et reprendre l'ébullition pendant 5 minutes. Congeler l'échantillon de protéine à -20 ° C.
5. Exécuter échantillons de protéines sur un 12% gel SDS-PAGE, transfert sur une membrane de nitrocellulose et d'effectuer Western blot avec des anticorps appropriés pour détecter la protéine d'intérêt. Dans cet exemple, nous sondons la présence de l'hémagglutinine (HA) taggés domaines Enth par incubation avec la souris anticorps anti-HA (Covance, Princeton, NJ) à 1:2000 dilution dans Blotto-Tween (1XPBS, 5% de lait écrémé sec , 0,1% Tween). HRP étiquetés de chèvre anti-anticorps de souris secondaire (Pierce) à une dilution de 1:2500, également en Blotto-Tween, est autorisé à lier l'anticorps primaire sur la membrane pendant 1 heure à température ambiante. Supersignal West Pico Substrat chimiluminescent est utilisé pour détecter HRP anticorps marqué souris anti.
6. Quantifier les niveaux d'expression de protéines par densitométrie.

Cette section décrit deux méthodes de développement phénotype de suivi en fonction des incrémentsasing concentration en protéines. La première méthode est basée population de cellules, tandis que la deuxième étude il au niveau d'une seule cellule.

Quantification de la division cellulaire et la mort cellulaire phénotype

1. A chaque point dans le temps, transférer 1 ml de suspension cellulaire dans un tube stérile eppendorf utilisant des techniques stériles et les cellules de récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 minutes.
2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 70μl médias, suivis par 30μl de bleu de méthylène à partir d'un stock de 1mg/ml dans l'eau stérile. Le bleu de méthylène est un colorant bleu vitale qui devient incolore dans l'environnement réducteur du cytosol où les cellules mortes peuvent être identifiés par leur couleur bleue.
3. Pipette ~ 6μl de cette suspension sur une lame de verre propre et placer une lamelle sur la goutte. Appuyer sur la lamelle doucement pour former une couche mince et uniforme de cellules entre les interfaces verre.
4. Diviser la lamelle en 9 quadrants et prendre 3 images par quadrant en salleicated la Fig. 2. Le nombre de cellules / champ ne doit pas être supérieur à 30 cellules pour permettre une quantification précise. Chaque lamelle peut être visualisé pendant environ 15 minutes avant que les bulles d'air endommager la préparation.
5. Compter le nombre de cellules présentant le phénotype à l'étude. Le défaut de la division cellulaire induite lors de ENTH2 surexpression conduit à la mort cellulaire et, par conséquent, nous avons également compter le nombre de cellules mortes identifiés par leur couleur bleue.
6. Calculer le pourcentage de cellules phénotypiques.
7. Tracer les données comme indiqué dans la Fig. 3.

Visualisation des phénotypes spécifiques à l'aide de la microscopie à fluorescence défauts

Division cellulaire des cellules défectueuses, comme on le voit sur ENTH2 surexpression, sont souvent caractérisés par des défauts de cellules mur et septines mislocalization3 (visualisé comme protéines de fusion GFP). La paroi cellulaire de la levure bourgeonnante peuvent être facilement visualisées par coloration avec calcofluor blanc (CFW) qui se lie irréversiblement à la chitine dans la levureles parois cellulaires.

1. A chaque fois 1ml point aliquotes, de la culture dans un tube stérile eppendorf et les cellules de récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante.
2. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 100 ul de solution CfW 1mg/ml dans l'eau stérile et incuber pendant 5 minutes à température ambiante dans l'obscurité.
3. Récolte des cellules par centrifugation et laver 3 fois avec du PBS 1X.
4. Reprendre le culot dans 100 ul de PBS 1X et de l'image au microscope optique à l'aide de la paroi cellulaire (UV) et filtre FITC (GFP-septines) à un grossissement de 100X.
5. Quantifier le pourcentage de cellules avec anomalie de la paroi cellulaire et la mauvaise localisation septines en suivant les étapes 4-6 dans la section B.2.1

B.3. Détermination du phénotype de développement au niveau de la cellule unique: la vidéo-microscopie time-lapse.

1. Nettoyer une lame de verre avec une dépression concave avec 70% d'alcool et laisser sécher à l'air.
2. Faire bouillir 0,06 g d'agarose dans 5ml milieux sélectifs qui n'ont pas methionine dans un tube de verre stérile dans un four micro-ondes jusqu'à ce que l'agarose dissout complètement.
3. Rapidement pipette 200 ul de l'agarose contenant médias dans la dépression diaporama et retourner une autre lame de verre propre sur elle, en veillant à ce qu'aucune bulle d'air n'est piégée en dessous.
4. Quand le gel se solidifie, déplacer le tiroir sans à-coup sur le dessus loin de la glissière dépression, en maintenant leurs surfaces parallèles à tout moment. Ceci assure que la surface du lit d'agarose est de niveau avec la surface de la lame dépression. Nettoyez la région de coulissement entourant le lit d'agarose avec un tissu délicat. La diapositive est maintenant prêt à être utilisé.
5. A l'heure = 4 heures, 1 ml de transfert de cellules de la culture dans un tube eppendorf stérile et la récolte par centrifugation à 2200 rpm pendant 5 min à température ambiante.
   Remarque: Il est recommandé un point dans le temps plus tard, être choisi pour assurer des niveaux élevés d'expression de la protéine ainsi que le développement phénotype est garanti. Des expériences pilotes sont tenus de determine temps d'induction au cas par cas.
6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de milieu sélectif frais dépourvus de méthionine.
7. Appliquer de la vaseline sur les bords de la lamelle. Ensuite, placez une goutte de suspension cellulaire au centre du lit d'agarose et répartie uniformément en appuyant doucement sur une lamelle sur eux.
8. Sceller les bords de la lamelle avec de la vaseline et de fixer sa position en alignant les bords avec du vernis à ongles. Attendez jusqu'à ce que le séchage de vernis à ongles.
9. Placez la lame sur une platine chauffante d'un microscope et choisissez un champ qui ne contient pas plus de 10 cellules espacées de manière adéquate. Comme les cellules se divisent, le champ sera pris d'assaut au fil du temps.
10. Prendre une image du champ de toutes les 5 minutes pendant ~ 5 heures. Progression phénotype peut être étudié par l'assemblage des images dans un film à l'aide du logiciel ImageJ ( Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov / ij /, 1997-2005)

Remarque: Nous utilisons microscope Zeiss Axiovert 200M, Zeiss Axiocam MRm monochrome appareil photo numérique et Carl Zeiss AxioVision logiciel d'acquisition d'image (version 4.4) pour l'imagerie de cellules vivantes. Contrôle de la température est obtenue en plaçant des diapositives sur une platine chauffante maintenue à 30 ° C par le TempControl PECON 37 périphérique.

Afin d'éviter de ré-ajuster la mise au point à plusieurs reprises, il est commode de programmer le logiciel d'acquisition d'images pour acquérir automatiquement quelques z-stack images à chaque point dans le temps et choisir l'image avec la meilleure mise au point plus tard, lors du montage du film. Certains logiciels d'acquisition d'image ont la possibilité de mise au point automatique pour des expériences suivies dans le temps. Il est commode d'utiliser cette option dans le cas échéant.

Cellules de levure de type sauvage poussent mieux à 30 ° C de contrôle où la température est critique. Afin deassurer une température adéquate, il est utile de fournir une source de chaleur externe, en plus de la platine chauffante. Par exemple, nous laissons la lumière transmise blanc du microscope pendant toute la durée de l'imagerie.

Il est également essentiel pour éviter les bulles d'air lors de la préparation du lit agarose et sandwich de cellule. L'air piégé dans les bulles se dilate lorsqu'il est chauffé dans le temps et ont tendance à pousser les cellules hors du champ représenté par une image.

Il est également important de s'assurer que les positions des cellules individuelles dans le domaine n'ont pas changé de façon appréciable au cours de la durée du processus d'imagerie, en particulier pendant les tentatives de recentrage. Plugins stabilisation d'image sont disponibles pour ImageJ pour remédier à de faibles variations de position de la cellule après le film a été monté. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Ce protocole décrit comment suivre le développement d'un phénotype morphologique (cellule de levure incapable de subir une division cellulaire proprement dite) sur surexpression de la protéine. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de récolter des cellules de levure par granulation à la vitesse de centrifugation recommandé que des vitesses plus rapides peuvent endommager les cellules et les résultats obscurs. Le bleu de méthylène et du blanc de calcofluor doit être ajoutée à des cellules vivantes, juste avant l'imagerie comme ils sont toxiques. Cette procédure peut également être facilement adapté pour phénotypes observés dans des conditions de répression de protéines, à condition que la cible est exprimé à partir d'un promoteur contrôlable.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2