Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Summary

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis

Abstract

Deleção do gene e superexpressão da proteína são métodos comuns para o estudo funções das proteínas. Neste artigo, descrevemos um protocolo para análise do desenvolvimento do fenótipo como uma função da concentração de proteína na população e de uma única célula em níveis

Protocol

A. Cultura de Células e indução de proteínas

Esta seção descreve as condições de cultura celular, ciclo celular sincronização com Nocodazol, seguida de indução da expressão da proteína a partir de um promotor regulável em células de levedura.

1. A cepa de levedura tipo selvagem W303 (leu2-3, 112 trp1-1 CAN1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) é transformada com cópia de alta (2μ) DNA plasmídeo que contém o nosso gene de interesse (ENTH2) sob o controle de um promotor de metionina-repressor (MET25). 2mM metionina é suficiente para suprimir a atividade do promotor, enquanto a mídia sem metionina permite a expressão máxima. Assim, uma gama de concentrações de metionina pode ser usado para expressar a proteína no nível desejado. Transformação de um plasmídeo de DNA em células W303 é feito usando o método LiAc-TE acordo com os procedimentos padrão. ²
   Nota: Este experimento deve ser realizado através do crescimento das células durante a noite, na presença de 2mM metionina para assegurar a expressão da proteína apenas em níveis de fundo. Na manhã seguinte, a expressão da proteína deve ser induzido pela ressuspensão das células em meios de falta de metionina imediatamente a sincronização do ciclo celular seguinte (cerca de 4h). No entanto, descobrimos que o ENTH2-dependente fenótipo divisão celular é induzida somente após uma concentração considerável de ENTH2 construiu nas células (geralmente depois de 4-6h de indução de proteínas ^3), fazendo o curso de tempo para a análise de todas as manifestações de o fenótipo muito longo (pelo menos 16h). Descobrimos que as células de crescimento durante a noite, na presença de 0,2 mM metionina reprime o fenótipo morfológico, mas permite a concentração de proteína subcrítica que podem ser rapidamente aumentado para fenótipo induzindo-os níveis, quando transferido para mídia sem metionina. Isto permite uma análise detalhada das manifestações graves do defeito a divisão celular em um período relativamente curto de tempo. Nós, portanto, recomendamos que o experimentador determinar a concentração de metionina, que é sub-limiar para a indução do fenótipo em uma base caso a caso.
2. Escolha seis colônias de uma placa contendo as células recém-transformada e inocular em 50 ml de meios seletivos com 0,2 mM de metionina em um frasco esterilizado cônica usando técnicas estéreis. Incubar durante a 30 ° C com agitação a 200 rpm. (Para mais informações sobre as condições de cultura padrão fermento, ver ref. 4)
3. Na manhã seguinte, a densidade de células estimativa através da medição da densidade óptica da cultura em 600nm. Transferir o equivalente a 20 OD _600nm de células em um tubo de centrifugação estéril e colheita girando a 2200 rpm durante 5min à temperatura ambiente.
4. Ressuspender as células em YPD em uma concentração de 0,4 OD _600nm / ml e adicionar Nocodazol para uma concentração final de 15μg/ml de partir de um estoque de 1mg/ml em DMSO. Incubar por 4h a 30 ° C com agitação em 200 rpm.
   Nota: Os métodos alternativos de prisão, incluindo parada na fase G0 usando fator alfa-ou em fase G1-S usando hidroxiuréia pode ser usado. Nós descobrimos que a prisão em mitose utilizando Nocodazol é simples e eficaz o suficiente para os nossos propósitos.
5. Após 4h, verifique porcentagem de células em mitose preso pela contagem do número de células com igual gomos de tamanho através da visualização no microscópio. Se a prisão for superior a 90%, avance para o passo seguinte. Caso contrário, manter as células em Nocodazol até que a porcentagem desejada de paragem da mitose é alcançado.
6. Células colheita por centrifugação a 2200 rpm para 5min e lave com água gelada por três vezes. Após a lavagem final, ressuspender o sedimento em meios seletivos falta de metionina, a uma densidade de células de ~ 0,5 OD _600nm / ml. Transferência de metade do volume de células para um novo tubo estéril e adicionar metionina para uma concentração final 0,2 mM. Isto irá servir como um controle para efeitos devido aos níveis basais de expressão da proteína. Isto marca o primeiro ponto do tempo do experimento (tempo = 0h). Analise as células a cada hora por 6h.

B. Análise do Desenvolvimento Fenótipo

Nota: Todos os métodos de análise descritos a seguir não precisam ser executadas simultaneamente.

Determinação dos níveis de expressão de proteínas por western Blotting

1. Em cada ponto do tempo, medir o OD _600nm da cultura e colheita 2 OD _600nm equivalentes de células por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos.
2. Ressuspender o sedimento em 1 ml de água estéril e transferir a suspensão para um tubo eppendorf de 1,5 ml. Repetir a centrifugação para obter uma pelota. Aspirar o sobrenadante.
3. Ressuspender o sedimento em 50μl tampão de amostra SDS-PAGE Laemmli (50 mM Tris pH 6,8, SDS 2%, glicerol 10%, 2% β-mercaptoetanol e 0,006% de azul de bromofenol). Adicionar 50μl de contas ácido lavou o vidro (diâmetro 0,2-0,4 microns) e vortex por 1 min.
4. Tubos de ferver em um 95 ° C de calor block por 2 minutos, vortex durante 30 segundos e recomeçar a ferver durante 5 minutos. Congelar a amostra de proteína a -20 ° C.
5. Executar amostras de proteínas em um gel 12% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose e executar Western blotting com anticorpos adequado para detectar a proteína de interesse. Neste exemplo, investigar a presença de hemaglutinina (HA) com a tag domínios ENTH pela incubação com o mouse de anticorpos anti-HA (Covance, Princeton, NJ), 1:2000 diluição em Blotto-Tween (1XPBS, 5% de leite sem gordura seca , 0,1% Tween). HRP tag anticorpo de cabra anti-rato secundário (Pierce) na diluição 1:2.500 de, também em Blotto-Tween, é permitido ligar o anticorpo primário na membrana por 1h em temperatura ambiente. Supersignal Substrato Pico Oeste Chemiluminescent é usado para detectar anticorpos do mouse HRP tagged anti.
6. Quantificar os níveis de expressão da proteína por densitometria.

Esta seção descreve dois métodos de desenvolvimento de fenótipo de rastreamento em função do aumento da concentração de proteína. O primeiro método é a célula de base populacional, enquanto os estudos de segundo, ao nível de uma única célula.

Quantificação de divisão celular e morte celular fenótipo

1. Em cada ponto do tempo, a transferência de 1 ml de suspensão celular para um tubo eppendorf estéril usando técnicas estéreis e células colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos.
2. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 70μl de mídia, seguidos por 30μl de metileno azul de um estoque de 1mg/ml em água estéril. Azul de metileno é um corante azul vital que se torne incolor no ambiente redutor do citoplasma, portanto, as células mortas podem ser identificados pela cor azul.
3. Pipeta ~ 6μl desta suspensão sobre uma lâmina de vidro limpa e coloque uma lamínula sobre a queda. Pressione a lamínula com cuidado para formar uma camada fina e uniforme de células entre as interfaces de vidro.
4. Divida a lamela em 9 quadrantes e tomar 3 imagens por quadrante, conforme indicado na figura. 2. O número de células / campo não deve ser maior que 30 células para permitir a quantificação precisa. Cada lamela pode ser trabalhada por aproximadamente 15 minutos antes que as bolhas de ar danificar a preparação.
5. Contar o número de células mostrando o fenótipo em estudo. O defeito divisão celular induzida sobre ENTH2 superexpressão leva à morte celular e, portanto, nós também contar o número de células mortas identificados pela cor azul.
6. Calcular a porcentagem de células fenotípicas.
7. Plotar os dados como mostrado na figura. 3.

Visualização do fenótipo específico defeitos usando microscopia de fluorescência

Divisão celular as células defeituosas, como visto em cima ENTH2 superexpressão, são muitas vezes caracterizados por defeitos da parede celular e mislocalization3 septina (visualizado como GFP fusão proteínas). A parede celular de levedura de brotamento podem ser facilmente visualizados através da coloração com calcofluor white (CFW), que se liga irreversivelmente a quitina na parede celular de levedura.

1. Em todos os tempos ponto de 1ml, alíquotas da cultura em um tubo eppendorf estéril e as células da colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.
2. Ressuspender o pellet celular em 100μl de solução CFW 1mg/ml em água estéril e incubar por 5 minutos em temperatura ambiente no escuro.
3. Colheita de células por centrifugação e lavar 3 vezes com PBS 1X.
4. Ressuspender o sedimento em 100μl de 1X PBS e imagem sob o microscópio usando óptica UV (parede celular) e FITC filtro (GFP-septina) com ampliação de 100X.
5. Quantificar porcentagem de células com defeito da parede celular e mislocalization septina seguindo os passos 4-6 na seção B.2.1

B.3. Determinação do fenótipo de desenvolvimento no nível da célula única: Time-lapse de microscopia de vídeo.

1. Limpar uma lâmina de vidro com uma depressão côncava com álcool 70% e deixar secar ao ar.
2. Ferva 0,06 g de agarose em 5ml meios seletivos falta de metionina em um tubo de vidro esterilizado no microondas até que a agarose se dissolva completamente.
3. 200μl rapidamente pipeta do agarose contendo mídia na depressão de slides e inverter uma outra lâmina de vidro limpa sobre ele, para que não se bolhas de ar ficam presos embaixo.
4. Quando o gel solidifica, mova o controle em cima sem problemas de distância da lâmina depressão, mantendo suas superfícies paralelas em todos os momentos. Isso garante que a superfície da cama agarose fique nivelada com a superfície da lâmina depressão. Limpe a região em torno da cama deslize agarose com um tecido delicado. O slide está pronto para uso.
5. Em tempo = 4 horas, 1 ml de transferência de células da cultura para um tubo eppendorf estéril e colheita por centrifugação a 2200 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente.
   Nota: Recomenda-se um tempo mais tarde ponto de ser escolhido para garantir altos níveis de expressão da proteína para que o desenvolvimento fenótipo é garantida. As experiências-piloto são obrigados a detere tempos de indução em uma base caso a caso.
6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 100μl de produtos frescos faltam meios seletivos metionina.
7. Aplique vaselina nas bordas da lamínula. Em seguida, coloque uma gota de suspensão de células no centro da cama e espalhar uniformemente agarose pressionando suavemente uma lamela sobre eles.
8. Selar as bordas da lamínula com vaselina e corrigir a sua posição, alinhando as bordas com unha polonês. Aguarde até que a seca unha polonês.
9. Coloque o slide em um palco aquecida de um microscópio e escolher um campo que não contém mais de 10 células espaçadas adequadamente. Como as células se dividem, o campo vai ficar lotada com o tempo.
10. Ter uma imagem do campo a cada 5 minutos para a 5 horas. Progressão fenótipo pode ser estudado por montar as imagens em um filme usando software ImageJ ( Rasband, WS, ImageJ, EUA National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EUA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Nota: Nós usamos microscópio Zeiss Axiovert 200M, Zeiss AxioCam MRM monocromática câmera digital e lente Carl Zeiss Axiovision software de aquisição de imagem (versão 4.4) para imagens de células vivas. Controle de temperatura é conseguida pela colocação de slides em um palco mantido aquecido a 30 ° C por 37 Pecon Tempcontrol dispositivo.

A fim de evitar re-ajustar o foco repetidamente, é conveniente para programar o software de aquisição de imagem para adquirir automaticamente alguns z-stack imagens em todos os tempos ponto-e escolher a imagem com o melhor foco mais tarde, quando a montagem do filme. Alguns softwares de aquisição de imagem tem a opção de foco automático para experimentos curso do tempo. É conveniente usar essa opção em quando disponível.

Células de levedura tipo selvagem crescem melhor a 30 ° C, portanto, de controle de temperatura é crítica. A fim de assegurar calor adequado, é útil para fornecer uma fonte externa de calor, além do estágio aquecida. Por exemplo, deixamos a luz transmitida branca do microscópio sobre para toda a duração da imagem.

Também é fundamental para evitar bolhas de ar ao preparar a cama agarose e sanduíche de celular. O ar preso dentro da bolha se expande quando aquecida ao longo do tempo e tendem a levar as células de distância do campo que está sendo fotografada.

Também é importante assegurar que as posições de células individuais dentro do campo não muda significativamente ao longo da duração do processo de imagem, especialmente durante a re-focalização tentativas. Plugins de estabilização de imagem estão disponíveis para ImageJ para corrigir pequenas mudanças na posição das células após o filme foi montado. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ kangli / / código Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Este protocolo descreve como monitorar o desenvolvimento de um fenótipo morfológico (célula de levedura capaz de se submeter a divisão celular propriamente dita) sobre superexpressão da proteína. Ao fazer este procedimento é importante para se lembrar de colher células de levedura por peletização na velocidade de centrifugação recomendada como velocidades mais rápidas podem danificar as células e os resultados obscuros. Azul de metileno e calcofluor branco deve ser adicionado ao vivo células pouco antes de imagens como elas são tóxicas. Este procedimento também pode ser facilmente adaptado para fenótipos observados em condições de repressão proteínas, desde que o alvo é expressa a partir de um promotor controlável.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2