Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Summary

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles

Abstract

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los niveles

Protocol

A. cultivo celular y la inducción de proteínas

En esta sección se describen las condiciones de cultivo celular, ciclo celular de sincronización con nocodazole, seguida por la inducción de la expresión de la proteína de un promotor regulable en células de levadura.

1. El tipo salvaje cepa de levadura W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) se transforma con la copia de alta (2μ) plásmido de ADN que contiene nuestro gen de interés (ENTH2) bajo el control de un promotor reprimible metionina (MET25). Metionina 2mM es suficiente para suprimir la actividad del promotor, mientras que los medios de comunicación carecen de metionina permite la máxima expresión. Por lo tanto, un rango de concentraciones de metionina se puede utilizar para expresar la proteína en el nivel deseado. Una transformación del plásmido de ADN en las células W303 se realiza mediante el método LiAc-TE de acuerdo con los procedimientos estándar de ^2.
   Nota: Este experimento debe ser realizado por cultivar las células durante la noche en la presencia de 2 mM metionina para asegurar la expresión de la proteína sólo en los niveles de fondo. A la mañana siguiente, la expresión de proteínas debe ser inducida por la resuspensión de las células en los medios de comunicación carecen de metionina inmediatamente después de la sincronización del ciclo celular (aproximadamente 4 horas). Sin embargo, hemos encontrado que el fenotipo de células ENTH2 dependiente de la división se induce sólo después de una considerable concentración de ENTH2 se ha acumulado en las células (normalmente después de 4-6h de la inducción de la proteína ^3), por lo que el transcurso del tiempo para el análisis de todas las manifestaciones de el fenotipo muy largo (por lo menos a las 16h). Hemos encontrado que el crecimiento de las células durante la noche en la presencia de metionina 0,2 reprime el fenotipo morfológico, pero permite la concentración de proteínas subcrítico que pueden aumentar rápidamente a los niveles de inducir el fenotipo cuando se transfiere a los medios de comunicación carecen de metionina. Esto permite un análisis detallado de las manifestaciones graves del defecto la división celular en un período relativamente corto de tiempo. Nosotros por lo tanto, recomendamos que el experimentador determinar la concentración de metionina que es por debajo del umbral para la inducción del fenotipo sobre una base caso por caso.
2. Escoger seis colonias de una placa que contiene las células transformado recientemente y se inoculan en 50 ml de medio selectivo con 0,2 metionina en un matraz cónico de esterilizar utilizando técnicas estériles. Incubar toda la noche a 30 ° C con agitación a 200 rpm. (Para más información sobre las condiciones estándar de cultivo de levadura, ver ref. 4)
3. A la mañana siguiente, la estimación de la densidad celular mediante la medición de la densidad óptica del cultivo a 600 nm. Transferir el equivalente a 20 OD _{600 nm} de las células en un tubo de centrífuga estéril y la cosecha de gira a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
4. Resuspender las células en YPD a una concentración de 0,4 OD _{600 nm} / ml y añadir nocodazole a una concentración final de 15μg/ml de partir de un stock de 1mg/ml en DMSO. Se incuba durante 4 horas a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
   Nota: Los métodos alternativos de detención incluido el arresto en la fase G0 con alfa-factor o en fase G1-S con hidroxiurea puede ser utilizado. Hemos encontrado que la detención de la mitosis con nocodazole es simple y efectivo para nuestros propósitos.
5. Después de 4 horas, comprobar el porcentaje de células detenidas en la mitosis, contando el número de células con igual tamaño de los brotes mediante la visualización en el microscopio. Si el paro es superior al 90%, pasar a la etapa siguiente. De lo contrario, mantener las células en nocodazole hasta el porcentaje deseado de arresto mitótico se logra.
6. Las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos y lavar con agua fría tres veces. Después del último lavado, resuspender el precipitado en medios selectivos que carecen de metionina a una densidad celular de ~ _{600 nm} 0,5 OD / ml. La transferencia de la mitad del volumen de las células a un tubo estéril y añadir nuevos metionina a una concentración de 0,2 mm final. Esto servirá como un control de los efectos debidos a los niveles basales de expresión de la proteína. Esto marca el primer punto de tiempo del experimento (tiempo = 0 h). Analizar las células de cada hora durante 6 horas.

B. Análisis para el Desarrollo Fenotipo

Nota: Todos los métodos de análisis se describen a continuación no es necesario llevar a cabo de forma simultánea.

Determinación de los niveles de expresión de la proteína por Western Blot

1. En cada punto del tiempo, medir el OD _600nm de la cultura y la cosecha 2 OD _600nm equivalentes de las células por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos.
2. Resuspender el precipitado en 1 ml de agua estéril y transferir la suspensión a un tubo eppendorf de 1,5 ml. Repetir la centrifugación para obtener un pellet. Aspirar el sobrenadante.
3. Resuspender el precipitado en 50μl de SDS-PAGE Laemmli muestra de amortiguación (50 mM Tris pH 6,8, SDS 2%, glicerol al 10%, 2% de β-mercaptoetanol y 0,006% azul de bromofenol). Añadir 50μl de perlas de vidrio lavado con ácido (0.2-0.4 micras de diámetro) y agitar durante 1 minuto.
4. Tubos de ebullición en un 95 ° C de calor block durante 2 minutos y agitar de nuevo durante 30 segundos y volver a hervir durante 5 minutos. Congelar la muestra de proteína a -20 ° C.
5. Ejecutar las muestras de proteínas en un 12% SDS-PAGE gel, transferencia a una membrana de nitrocelulosa y realizar Western Blot con anticuerpos adecuados para detectar la proteína de interés. En este ejemplo, la sonda de la presencia de la hemaglutinina (HA) etiquetados dominios Enth mediante la incubación con el ratón anticuerpos anti-HA (Covance, Princeton, NJ) en la dilución 1:2000 en BLOTTO-Tween (1XPBS, 5% sin grasa leche en polvo , 0,1% Tween). HRP etiquetados de cabra anti-anticuerpo secundario del ratón (Pierce) a una dilución de 1:2500, también en Blotto-Tween, se permite obligar a la primaria de anticuerpos en la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente. Supersignal sustrato West Pico quimioluminiscente se utiliza para detectar anticuerpos de ratón HRP etiquetados contra.
6. Cuantificar los niveles de expresión de la proteína por densitometría.

Esta sección describe dos métodos de desarrollo de fenotipo de seguimiento en función de la concentración de proteínas en aumento. El primer método consiste en células de base poblacional, mientras que los estudios de segundo en el nivel de una sola célula.

La cuantificación del fenotipo de la división celular y muerte celular

1. En cada punto del tiempo, la transferencia de 1 ml de suspensión celular a un tubo estéril eppendorf con técnicas estériles y las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos.
2. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 70μl los medios de comunicación, seguido de metileno 30μl azul de un stock de 1mg/ml en agua estéril. El azul de metileno es un colorante azul vital que se vuelve incolora en el entorno de la reducción del citosol por lo tanto, las células muertas se pueden identificar por su color azul.
3. Pipeta ~ 6μl de esta suspensión en un portaobjetos de vidrio limpio y coloque un cubreobjetos sobre la gota. Presione suavemente el cubreobjetos para formar una capa fina y uniforme de las células entre las interfaces de vidrio.
4. Divide el cubreobjetos en 9 cuadrantes y tomar tres imágenes por cuadrante, como se indica en la figura. 2. El número de células / campo no debe ser mayor de 30 células para permitir la cuantificación exacta. Cada portaobjetos se pueden obtener imágenes durante unos 15 minutos antes de las burbujas de aire daño a la preparación.
5. Cuente el número de células que muestran el fenotipo en estudio. El defecto en la división celular inducida por la sobreexpresión ENTH2 conduce a la muerte celular y, por tanto, también contamos con el número de células muertas identificadas por su color azul.
6. Calcular el porcentaje de células fenotípica.
7. Representar los datos como se muestra en la figura. 3.

Visualización del fenotipo específico defectos mediante microscopía de fluorescencia

La división celular, las células defectuosas, como se ve en ENTH2 sobreexpresión, se caracterizan a menudo por defectos de la pared celular y septina mislocalization3 (visualizado como proteínas de fusión GFP). La pared celular de la levadura en ciernes pueden ser fácilmente visualizados por tinción con blanco de calcoflúor (CFW), que se une irreversiblemente a la quitina en las paredes celulares de la levadura.

1. 1 ml en cada alícuota punto de tiempo, de la cultura en un tubo estéril eppendorf y las células de la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
2. Resuspender el botón celular en 100μl de la solución de 1mg/ml CFW en agua estéril y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
3. Las células de la cosecha por centrifugación y lavado 3 veces con PBS 1X.
4. Resuspender el precipitado en 100μl PBS 1X y la imagen bajo el microscopio utilizando la óptica UV (pared celular) y el filtro FITC (GFP-septina) con una ampliación de 100X.
5. Cuantificar el porcentaje de células con defectos de la pared celular y la deslocalización septina siguiendo los pasos 4-6 en el apartado B.2.1

B.3. Determinación de desarrollo en el fenotipo de célula de nivel simple: Time-lapse microscopía de vídeo.

1. Limpiar un portaobjetos de vidrio con una depresión cóncava con un 70% de alcohol y dejar secar al aire.
2. Hervir 0.06g de agarosa en 5 ml medios selectivos que carecen de metionina en un tubo de vidrio estéril en un horno de microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.
3. Rápidamente 200μl pipeta de la agarosa que contiene los medios de comunicación en la depresión de diapositivas e invertir otro portaobjetos de vidrio limpio sobre ella, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo.
4. Cuando el gel se solidifica, mover la diapositiva en la parte superior sin problemas fuera de la diapositiva depresión, manteniendo sus superficies paralelas en todo momento. Esto asegura que la superficie de la cama de agarosa al ras de la superficie de la diapositiva depresión. Limpie la zona de diapositivas rodean la cama de agarosa con un delicado tejido. La diapositiva está listo para su uso.
5. En el tiempo = 4 horas, 1 ml de la transferencia de células de la cultura a un tubo estéril eppendorf y la cosecha por centrifugación a 2200 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   Nota: Se recomienda un tiempo después del punto se elegirá para asegurar altos niveles de expresión de la proteína para que el desarrollo fenotipo está garantizada. Experiencias piloto están obligados a detere los tiempos de inducción sobre una base caso por caso.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 100μl de agua dulce carecen de medios selectivos metionina.
7. Aplique vaselina en los bordes del cubreobjetos. A continuación, coloque una gota de suspensión celular en el centro de la cama de agarosa y se repartirán uniformemente presionando suavemente un cubreobjetos sobre ellos.
8. Sellar los bordes del cubreobjetos con vaselina y fijar su posición, alineando los bordes con esmalte de uñas. Espere hasta que se seque el esmalte de uñas.
9. Colocar la placa en un escenario caliente de un microscopio y elegir un campo que no contiene más de 10 células espaciadas adecuadamente. Como las células se dividen, el campo se llene con el tiempo.
10. Tomar una imagen del campo cada 5 minutos durante ~ 5 horas. Progresión fenotipo puede ser estudiado mediante el ensamblaje de las imágenes en una película utilizando el software ImageJ ( Rasband, WS, ImageJ, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Nota: Usamos Zeiss Axiovert 200M microscopio Zeiss Axiocam MRM blanco y negro de la cámara digital y lente Carl Zeiss imagen Axiovision adquisición de software (versión 4.4) para imágenes de células vivas. El control de temperatura se logra mediante la colocación de diapositivas en un escenario calentado mantuvo a 30 ° C por la PECON Tempcontrol 37 dispositivo.

Con el fin de evitar volver a ajustar el enfoque en repetidas ocasiones, es conveniente programar el software de adquisición de imágenes para adquirir de forma automática unos pocos z-stack imágenes en cada punto del tiempo y elegir la imagen con el mejor enfoque más tarde, cuando el montaje de la película. Algunos programas de adquisición de imágenes tienen la opción de enfoque automático de experimentos de tiempo. Es conveniente utilizar esta opción en la que esté disponible.

Salvaje células de levadura tipo crecen mejor a 30 ° C por lo tanto, el control de la temperatura es crítica. A fin de asegurar una calefacción adecuada, es útil para proporcionar una fuente de calor externa, además de la etapa de calefacción. Por ejemplo, dejamos la luz transmitida blanca del microscopio para toda la duración de las imágenes.

También es fundamental para evitar las burbujas de aire en la preparación de la cama de agarosa y un bocadillo de la célula. El aire atrapado en las burbujas se expande cuando se calienta con el tiempo y tienden a empujar a las células fuera del campo se va a examinar.

También es importante asegurarse de que las posiciones de células individuales en el campo no cambian apreciablemente durante la duración del proceso de imagen, sobre todo durante la re-enfoque intentos. Plugins de estabilización de imagen están disponibles para ImageJ para corregir pequeños cambios en la posición de la célula después de la película ha sido montada. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Este protocolo describe la manera de supervisar el desarrollo de un fenotipo morfológico (célula de levadura no pueden someterse a la división celular adecuada) a sobreexpresión de la proteína. Cuando se realiza este procedimiento, es importante recordar que la cosecha de células de levadura por granulación a la velocidad de centrifugado se recomienda como una mayor velocidad puede dañar las células y los resultados oscuro. El azul de metileno y el blanco calcofluor debe agregarse a las células vivas justo antes de la imagen, ya que son tóxicos. Este procedimiento también se puede adaptar fácilmente para los fenotipos observados en condiciones de represión de proteínas, siempre y cuando el objetivo se expresa de un promotor controlable.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2