Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Summary

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in

Abstract

Gene Löschungs-und Protein-Überexpression sind gängige Methoden zur Untersuchung von Funktionen von Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für die Analyse der Phänotyp Entwicklung als eine Funktion der Protein-Konzentration in der Bevölkerung und Single-Cell-Ebenen in

Protocol

A. Zellkultur und Protein Induction

Dieser Abschnitt beschreibt Zellkulturbedingungen, Zellzyklus-Synchronisation mit Nocodazol, durch Induktion der Proteinexpression von einem regulierbaren Promotor in Hefe-Zellen gefolgt.

1. Die Wildtyp-Hefestamm W303 (leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11, 15) ist mit hoher Kopienzahl (2μ) Plasmid-DNA, die unsere Gen von Interesse (ENTH2) enthält unter der Kontrolle verwandelt eines Methionin-repressible Promotor (MET25). 2mM Methionin ist ausreichend, um die Promotoraktivität zu unterdrücken, während Medien fehlt Methionin ermöglicht maximale Expression. Somit kann eine Reihe von Methionin-Konzentrationen verwendet werden, um das Protein auf dem gewünschten Niveau zu äußern. 1 Transformation von Plasmid-DNA in Zellen W303 erfolgt über die LiAc-TE-Methode gemäß Standardverfahren. ²
   Hinweis: Dieses Experiment sollte, indem die Zellen über Nacht in Gegenwart von 2 mM Methionin-Protein-Expression nur im Hintergrund Ebenen zu gewährleisten durchgeführt werden. Am nächsten Morgen sollte die Proteinexpression durch Resuspendieren der Zellen in Medien fehlt Methionin unmittelbar nach Zellzyklus-Synchronisation (ca. 4h) induziert werden. Allerdings haben wir festgestellt, dass die ENTH2-abhängige Zellteilung Phänotyp induziert wird (in der Regel nach 4-6h von Protein-Induktion ³⁾ erst mit einer erheblichen Konzentration von ENTH2 hat sich in den Zellen gebaut, was den zeitlichen Verlauf der Analyse aller Erscheinungsformen des der Phänotyp sehr lange (mindestens 16h). Wir haben festgestellt, dass das Wachstum der Zellen über Nacht in Gegenwart von 0,2 mM Methionin unterdrückt die morphologischen Phänotyp, sondern ermöglicht unterkritischen Proteinkonzentration, die schnell auf-Phänotyp-induzierenden Ebenen erhöht werden kann, wenn die Medien fehlen Methionin übertragen. Dies ermöglicht eine detaillierte Analyse der schweren Erscheinungsformen der Zellteilung Defekt in einem relativ kürzerer Zeit. Wir empfehlen daher, dass der Experimentator die Methionin-Konzentration, die unterhalb der Schwelle für Phänotyp Induktion auf einer Fall-zu-Fall-Basis zu ermitteln.
2. Wählen sechs Kolonien aus einer Platte, die vor kurzem transformierten Zellen und impfen in 50 ml von selektiven Medien mit 0,2 mm Methionin in einem sterilisierten Erlenmeyerkolben mit Standard-sterile Techniken. Inkubieren über Nacht bei 30 ° C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute. (Für weitere Informationen über Standard-Hefekultur Bedingungen, vgl. Rz. 4)
3. Am nächsten Morgen, schätzen Zelldichte durch Messung der optischen Dichte der Kultur bei 600nm. Übertragen Sie die Höhe von 20 OD _600nm von Zellen in ein steriles Zentrifugenröhrchen und Ernte durch Spinnen bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
4. Die Zellen in einer Konzentration von 0,4 OD _600nm / ml YPD und fügen Nocodazol, um eine endgültige Konzentration von 15μg/ml von einem Bestand von 1mg/ml in DMSO. Inkubieren 4h bei 30 ° C unter Schütteln bei 200rpm.
   Hinweis: Alternative Verhaftung Methoden einschließlich Verhaftung an der G0-Phase mit alpha-Faktor-oder G1-S-Phase mit Hydroxyurea eingesetzt werden kann. Wir haben festgestellt, dass Verhaftung bei der Mitose mit Nocodazol einfach und effektiv genug für unsere Zwecke ist.
5. Nach 4h, überprüfen Prozentsatz an Zellen in der Mitose durch Zählen der Anzahl der Zellen mit gleich großen Knospen, indem Sie unter dem Mikroskop verhaftet. Wenn die Verhaftung von mehr als 90% auf den folgenden Schritt fort. Ansonsten halten Zellen in Nocodazol, bis der gewünschte Prozentsatz der Mitose erreicht wird.
6. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten und wäscht mit eiskaltem Wasser dreimal. Nach dem letzten Waschen, das Pellet in selektiven Medien fehlt Methionin in einer Zelldichte von ~ 0,5 OD _600nm / ml. Übertragung der Hälfte des Volumens von Zellen zu einem neuen sterilen Röhrchen und fügen Methionin, um eine endgültige Konzentration 0,2 mM. Dies wird als Kontrolle für Effekte aufgrund basalen Ebenen der Proteinexpression dienen. Dies ist das erste Mal-Punkt des Experiments (Zeit = 0h). Analysieren Sie die Zellen jede Stunde für 6h.

B. Analyse der Phänotyp Entwicklung

Hinweis: Alle die Analyse unten beschriebenen Methoden müssen nicht gleichzeitig durchgeführt werden.

Bestimmung von Protein-Expression mittels Western Blot

1. Bei jedem Zeit-Punkt, messen Sie die OD _600nm von der Kultur und Ernte 2 OD _600nm Äquivalente der Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten.
2. Das Pellet in 1 ml sterilem Wasser und übertragen Sie die Suspension auf eine 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Zentrifugation zu einem Pellet zu erhalten. Den Überstand aspirieren.
3. Das Pellet in 50 ul SDS-PAGE Laemmli-Probenpuffer (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 2% β-Mercaptoethanol und 0,006% Bromphenolblau). Add 50 ul des Säure-gewaschene Glasperlen (0.2-0.4 Mikron Durchmesser) und Wirbel für 1 min.
4. Boil Röhrchen auf einem 95 ° C Hitze block für 2 Minuten, Wirbel wieder für 30 Sekunden und wieder kochendes für 5 Minuten. Einfrieren der Proteinprobe bei -20 ° C.
5. Run Protein-Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, Transfer auf eine Nitrozellulosemembran und führen Western-Blot mit den entsprechenden Antikörpern gegen das Protein von Interesse zu erkennen. In diesem Beispiel Sonde wir das Vorhandensein von Hämagglutinin (HA) markiert ENTH Domains durch Inkubation mit Maus-Anti-HA-Antikörper (Covance, Princeton, NJ) bei 1:2000-Verdünnung in Blotto-Tween (1XPBS, 5% fettfreier Trockenmilch , 0,1% Tween). HRP markierten Ziege anti-Maus Sekundärantikörper (Pierce) in einer Verdünnung von 1:2500, auch in Blotto-Tween, darf an den primären Antikörper auf der Membran für 1h bei Raumtemperatur zu binden. Supersignal West Pico Chemilumineszenzsubstrat wird verwendet, um HRP markierten anti-Maus-Antikörper erkennen.
6. Quantifizierung der Proteinexpression Ebenen durch Densitometrie.

Dieser Abschnitt beschreibt zwei Methoden der Tracking-Phänotyp Entwicklung in Abhängigkeit von steigender Proteinkonzentration. Die erste Methode ist Zell-Population basiert, während die zweite Studien auf der Ebene einer einzelnen Zelle.

Die Quantifizierung der Zellteilung Phänotyp und Zelltod

1. Zu jeder Zeit-Punkt, Transfer 1ml Zellsuspension in ein steriles Eppendorf-Röhrchen mit sterilen Techniken und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten.
2. Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 70μl Medien, von 30μl Methylenblau aus einem Bestand von 1mg/ml in sterilem Wasser gefolgt. Methylenblau ist ein blauer Vitalfarbstoffs dass farblos in der reduzierenden Umgebung des Cytosol damit toten Zellen können durch ihre blaue Farbe identifiziert werden wird.
3. Pipette ~ 6μl dieser Suspension auf einen sauberen Glasobjektträger und setzen Sie ein Deckglas über die Tropfen. Drücken Sie die Deckglas vorsichtig, um eine dünne, gleichmäßige Schicht von Zellen zwischen den Glas-Grenzflächen zu bilden.
4. Teilen Sie dem Deckglas in 9 Quadranten und nehmen Sie 3 Bilder pro Quadranten wie in Abb.. 2. Die Anzahl der Zellen / Feld sollte nicht größer als 30 Zellen eine genaue Quantifizierung. Jedes Deckglas kann für ca. 15 Minuten dargestellt werden, bevor Luftblasen Schaden der Vorbereitung.
5. Zählen Sie die Anzahl der Zellen, die den Phänotyp unter studieren. Die Zellteilung Fehler auf ENTH2 Überexpression induzierten führt zum Zelltod und damit wir auch zählen die Anzahl der toten Zellen durch ihre blaue Farbe gekennzeichnet.
6. Berechnen Sie den Anteil der phänotypischen Zellen.
7. Zeichnen Sie die Daten wie in Abb.. 3.

Visualisierung von Phänotyp-spezifische Defekte mittels Fluoreszenzmikroskopie

Zellteilung defekten Zellen, wie auf ENTH2 Überexpression gesehen haben, sind oft von Zellwand Mängel und Septin mislocalization3 (visualisiert als GFP-Fusionsproteine) gekennzeichnet. Die Zellwand von Hefezellen kann leicht durch Färbung mit Calcofluor White (CFW), die irreversibel bindet in Hefe-Zellwände Chitin.

1. Bei jedem Zeit-Punkt, Aliquot 1 ml Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte Zellen durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
2. Zellpellet in 100 &mgr; l von 1mg/ml CfW Lösung in sterilem Wasser und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
3. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und 3 x waschen mit 1X PBS.
4. Das Pellet in 100 &mgr; l 1X PBS und Bild unter dem Mikroskop mit UV-Optik (Zellwand) und FITC-Filter (GFP-Septin) bei 100-facher Vergrößerung.
5. Quantify Anteil der Zellen mit Zellwand Mangels und Septin mislocalization durch folgende Schritte 4-6 in Abschnitt B.2.1

B.3. Bestimmung des Phänotyps Entwicklung an der einzelnen Zelle Ebene: Zeitraffer-Video-Mikroskopie.

1. Saubere einem Glasträger mit einer konkaven Vertiefung mit 70% Alkohol und an der Luft trocknen.
2. Boil 0,06 g Agarose in 5ml selektiven Medien fehlt Methionin in einem sterilen Glasröhrchen in der Mikrowelle, bis die Agarose vollständig auflöst.
3. Schnell Pipette 200 ul der Agarose mit Medien in der Folie Depression und invertieren Sie einen sauberen Glasobjektträger über sie darauf achten, dass keine Luftblasen unter gefangen sind.
4. Wenn das Gel erstarrt, stellen Sie den Schieberegler auf der Oberseite glatt weg von der Depression rutschen, halten ihre Flächen parallel zu allen Zeiten. Dies gewährleistet, dass die Oberfläche der Agarose Bett bündig mit der Oberfläche der Mulde gleiten kann. Reinigen Sie die Folie Region um die Agarose Bett mit einem feinen Gewebe. Die Folie ist nun einsatzbereit.
5. Zum Zeitpunkt = 4 Stunden, Transfer 1ml von Zellen aus der Kultur in ein steriles Eppendorf-Röhrchen und Ernte durch Zentrifugation bei 2200 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Es wird empfohlen, zu einem späteren Zeit-Punkt gewählt, um ein hohes Maß an Protein-Expression zu gewährleisten, so dass Phänotyp Entwicklung garantiert werden. Pilotversuche sind determin erforderliche Induktionszeiten auf einer Fall-zu-Fall-Basis.
6. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 100 &mgr; l frisches selektiven Medien fehlt Methionin.
7. Vaseline, um die Ränder des Deckglases. Dann geben Sie einen Tropfen der Zellsuspension in der Mitte der Agarose Bett und breitete einheitlich durch leichtes Drücken auf einem Deckglas über sie.
8. Seal die Ränder des Deckglases mit Vaseline und fixieren ihre Position durch die Auskleidung die Ränder mit Nagellack. Warten Sie, bis der Nagellack trocknet.
9. Legen Sie die Folie auf einem beheizten eines Mikroskops, und wählen Sie ein Feld, das nicht mehr als 10 Zellen verteilt ausreichend enthält. Wie sich Zellen teilen, wird das Feld im Laufe der Zeit überfüllt.
10. Nehmen Sie ein Bild des Feldes alle 5 Minuten für ca. 5 Stunden. Phänotyp Fortschreiten kann durch Zusammenfügen der Bilder in einen Film mit ImageJ-Software (studiert werden Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997 -2005 )

Hinweis: Wir verwenden Zeiss Axiovert 200M Mikroskop, monochrome Zeiss AxioCam MRm Digitalkamera und Carl Zeiss AxioVision Bildaufnahme-Software (Version 4.4) für Live Cell Imaging. Die Temperaturregelung erfolgt, indem gleitet auf einer beheizten Bühne bei 30 ° C durch die Pecon TempControl 37 medizinischen Geräten erzielt.

Um zu vermeiden, re-Einstellung des Fokus wiederholt, ist es zweckmäßig, die Bildaufnahme-Software-Programm, um automatisch erwerben ein paar Z-Stapel-Bildern zu jeder Zeit-Punkt, und wählen Sie das Bild mit dem besten Fokus später bei der Montage des Films. Einige Bildaufnahme Software haben die Möglichkeit, Autofokus für zeitliche Verlauf Experimente. Es ist zweckmäßig, diese Option ein, wenn verfügbar ist.

Wildtyp-Hefezellen wachsen am besten bei 30 ° C damit Temperaturregelung ist kritisch. Um eine ausreichende Wärme zu gewährleisten, ist es hilfreich, einen externen Wärmequelle neben dem beheizten Bühne bieten. Zum Beispiel lassen wir die übertragenen weißem Licht des Mikroskops auf für die gesamte Dauer der Bildgebung.

Es ist auch wichtig, um Luftblasen zu vermeiden, wenn die Vorbereitung der Agarose Bett und Zell-Sandwich. Die Luft in den Blasen eingeschlossene erweitert, wenn im Laufe der Zeit erhitzt und neigen dazu, Zellen wegschieben aus dem Bereich abzubildenden.

Es ist auch wichtig, dass einzelne Zelle Positionen innerhalb des Feldes werden, nicht wesentlich ändert über die Dauer der bildgebenden Verfahren, vor allem während der Re-Fokussierung versucht. Bildstabilisierung Plugins sind verfügbar für ImageJ kleine Verschiebungen in der Zelle Position zu korrigieren, um nach dem Film montiert worden ist. ( http://www.cs.cmu.edu/ ~ Kangli / code / Image_Stabilizer.html ).

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Entwicklung eines morphologischen Phänotyp (Hefezelle nicht korrekte Zellteilung) auf Protein-Überexpression zu überwachen. Wenn Sie dieses Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, um Hefezellen durch Pelletierung bei der empfohlenen Zentrifugationsgeschwindigkeit als höhere Geschwindigkeiten Zellen und obskuren Ergebnisse Schäden können zu ernten. Methylenblau und Calcofluor weiß sollte hinzugefügt werden, um Zellen kurz vor der Bildgebung leben, wie sie giftig sind. Dieses Verfahren kann auch leicht für Phänotypen unter Protein Repression Bedingungen beobachtet angepasst werden, sofern das Ziel von einem steuerbaren Promotors exprimiert.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2