在芽殖酵母中的蛋白浓度的功能形态学表型的发展分析

Summary

基因缺失和蛋白表达研究蛋白质功能的常用方法。在这篇文章中，我们描述了作为一个人口功能的蛋白浓度和单细胞水平分析表型的发展协议

Abstract

基因缺失和蛋白表达研究蛋白质功能的常用方法。在这篇文章中，我们描述了作为一个人口功能的蛋白浓度和单细胞水平分析表型的发展协议

Protocol

A.细胞培养和蛋白质感应

本节介绍了细胞培养条件下，从regulatable启动子在酵母细胞中蛋白表达诱导细胞周期同步，与噻氨酯哒唑。

1. 在野生型酵母株W303（LEU2 - 3，112 TRP1 - 1 CAN1 - 100 URA3 - 1 ADE2 - 1 HIS3 - 11，15）是转变高复制（2μ）的质粒DNA，包含的控制下我们感兴趣的基因（ENTH2）蛋氨酸repressible子（MET25）。 2MM蛋氨酸足以抑制启动子活性，而缺乏蛋氨酸的媒体允许的最大表达。因此，蛋氨酸浓度范围内可用于表达蛋白质的理想水平。 1 W303细胞的质粒DNA转化LiAc - TE的方法是使用按标准程序。
   注意：此试验应执行中存在2mm的蛋氨酸，以确保只在背景水平蛋白表达的细胞生长隔夜。第二天早晨，蛋白表达应引起resuspending细胞缺乏蛋氨酸紧随细胞周期同步（约4小时）的媒体 。 然而，我们发现，ENTH2依赖细胞分裂表型诱导后，才在相当集中的ENTH2已建成的细胞（通常在4 - 6H蛋白诱导^3），使所有表现形式的分析日久非常冗长（至少16小时）的表型。我们发现，越来越多的细胞在0.2MM蛋氨酸的存在一夜之间压抑形态的表型，但允许亚临界蛋白浓度，可以迅速提高到表型诱导水平转移到媒体缺乏蛋氨酸。 这允许在相对 ​​较短的时间内细胞分裂缺陷严重的表现形式进行详细的分析 。 因此，我们建议实验者确定蛋氨酸的浓度是在逐案基础上的表型诱导的亚阈值。
2. 挑选一个含有50毫升蛋氨酸在灭菌的锥形烧瓶中使用标准的无菌技术与0.2MM的选择性培养基板最近转化的细胞和接种的6个殖民地。孵育过夜30 ° C的晃动在200转（标准的酵母培养条件的详细信息，参见文献4）
3. 第二天早上，估计在600nm处测量光密度的文化细胞密度。转移到无菌的离心管和收获相当于20 _外径600nm处的细胞在室温下为5分钟旋转2200转。
4. 在悬浮细胞YPD在0.4 OD _600nm处 /毫升的浓度，并添加到终浓度为15μg/ml的股票从DMSO为1mg/ml噻氨酯哒唑。在30℃孵育4h后晃动在200rpm。
   注：可用于替代逮捕的方法，包括在使用α-因子的G0期或G1 - S期使用羟基脲逮捕。我们已经发现，在有丝分裂逮捕，用噻氨酯哒唑是简单而有效的，对于我们的目的的。
5. 4h后，检查被捕的有丝分裂细胞计数与相同大小的芽细胞的数量，在显微镜下观看的百分比。如果逮捕的是大于90％，继续以下步骤。否则，维持细胞在噻氨酯哒唑，直到实现所需的百分比有丝分裂逮捕。
6. 在2200转5min后，用冰水洗脸三次，离心收集细胞。最后一次洗涤后，重悬沉淀〜0.5 OD _600nm处 / ml的细胞密度在缺乏蛋氨酸选择性媒体。转移到一个新的无菌管细胞体积的一半，最后的0.2mm的浓度和添加蛋氨酸。这将作为一个控制蛋白表达的基础水平的影响。这标志着实验（时间= 0H）第一次点。分析细胞每隔一小时为6H。

B.分析表型发展

注意：下面描述的所有的分析方法并不需要同时进行 。

Western印迹法测定蛋白质表达水平

1. 在每个时间点，在2200转离心5分钟测量的文化和收获2外径_600nm处等值细胞的_{OD 600nm}处。
2. 在1毫升无菌水重悬沉淀和暂停转移到1.5ml的Eppendorf管中。离心重复获得沉淀。吸出上清液。
3. 50μL的SDS - PAGE Laemmli样品缓冲液（50MM三pH值6.8，2％SDS，10％甘油，2％β-巯基乙醇和0.006％溴酚蓝）重悬沉淀。加入50μL酸洗玻璃珠（直径0.2-0.4微米）和1分钟的旋涡。
4. 在95℃加热BLO煮沸管CK为2分钟，旋涡，再次为30秒，恢复煮沸5分钟。冻结在-20 ° C的蛋白质样品
5. 运行在12％SDS - PAGE凝胶转移到硝酸纤维素膜和蛋白质样品进行西医结合相应的抗体杂交检测感兴趣的蛋白质。在这个例子中，我们探测血凝素标记的鼠抗HA抗体（Covance公司，普林斯顿，新泽西州）的孵化1:2000稀释烂醉的吐温（1XPBS，5％的非脱脂奶粉ENTH域（“房委会”）的存在，0.1％吐温）。在1:2500稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗（皮尔斯），也是在烂醉的吐温，允许绑定上半年的膜在室温下的主要抗体。的Supersignal西Pico化学发光底物是用来检测辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体。
6. 光密度量化蛋白表达水平。

本节介绍两种方法跟踪蛋白浓度增加的功能表型的发展。第一种方法是细胞人口为基础的，而第二个研究它在单个细胞的水平。

量化表型的细胞分裂和细胞死亡

1. 在每一个时间点，转移1毫升细胞悬液以无菌Eppendorf管中，在2200转离心5分钟使用无菌技术和收获细胞。
2. 吸上清颗粒，悬浮在70μl媒体30μl甲基蓝从无菌水的股票为1mg/ml亚甲蓝是一个至关重要的蓝色染料，因此死亡的细胞可以通过他们的蓝色确定细胞质减少环境变得无色。
3. 移液器〜6μl这种悬挂在洁净的载玻片和盖玻片放置在下降。轻轻按下盖玻片，形成一层很薄的一层均匀，细胞之间的玻璃接口。
4. 分成9象限盖玻片，并采取3个象限的图像，如图所示。 2。细胞/场的数量应不超过30个细胞，以便准确定量。约15分钟可成像每个盖玻片，气泡破坏前的准备。
5. 统计显示所研究的表型的细胞数量。后ENTH2过度表达引起的细胞分裂的缺陷，导致细胞死亡，因此，我们也算他们的蓝色标识的死细胞的数量。
6. 计算表型细胞的百分比。
7. 绘制如图所示的数据。 3。

用荧光显微镜的特定表型缺陷的可视化

有缺陷的细胞，细胞分裂ENTH2过度表达时，往往细胞壁缺陷和septin mislocalization3（GFP融合蛋白的可视化）的特点。芽殖酵母的细胞壁可以很容易地Calcofluor白（CFW）不可逆转地结合甲壳素在酵母细胞壁染色观察。

1. 在每一个时间点，文化等分在无菌Eppendorf管中，并在室温下5分钟2200转离心收获细胞1毫升。
2. 1mg/ml的无菌水，并培育CFW溶液100μL重悬细胞沉淀在室温下5分钟，在黑暗中。
3. 离心收集细胞，用1X PBS洗3次。
4. 在100X的放大倍率，重悬于100μL1X PBS颗粒和使用紫外线光学显微镜下的图像（细胞壁）和FITC过滤器（GFP - septin）。
5. 通过以下步骤4-6在第B.2.1节细胞的百分比量化细胞壁缺陷和septin mislocalization

B.3。在单细胞水平测定表型的发展：定时视频显微镜。

1. 用70％酒精清洁玻片上，一个凹不景气使空气干燥。
2. 5毫升选择性培养基，缺乏蛋氨酸在微波无菌玻璃试管，直到琼脂糖完全溶解，煮沸0.06克琼脂糖。
3. 快速吸管琼脂糖200μL包含在幻灯片中抑郁症的媒体和反转另一块干净的载玻片，确保被困于车底，无气泡。
4. 凝胶固化时，在上面移动幻灯片顺利，远离抑郁症的幻灯片，在任何时候都保持其表面平行。这将确保琼脂糖床表面与表面抑郁幻灯片平齐。清洁幻灯片周边地区琼脂糖床用细腻的组织。幻灯片是现在可以使用了。
5. 在时间为4小时，从文化细胞转移到无菌Eppendorf管中，并在室温下5分钟2200转离心收获1毫升。
   注：建议以后的时间点选择，以保证蛋白的表达水平高，使表型的发展是保证 。 试点实验，以确定E对诱导时间的案件逐案基础上。
6. 吸新鲜的选择性培养基，缺乏蛋氨酸100μL上清，悬浮细胞。
7. 凡士林盖玻片边缘。然后下降琼脂糖床中央放置一个细胞悬液和扩散均匀，轻轻按压盖玻片。
8. 用凡士林密封盖玻片边缘和修复衬里用指甲油的边缘地位。等待，直到指甲油变干。
9. 放置在显微镜加热阶段的幻灯片，然后选择一个字段，它包含足够的间隔不超过10个细胞。随着细胞分裂时，该领域将随着时间的推移显得很拥挤。
10. 以一个领域的形象〜5小时，每5分钟。表型的进展，可组装成的图像，使用ImageJ软件（ 电影Rasband，WS，ImageJ，美国，马里兰州贝塞斯达，美国，http://rsb.info.nih.gov/ij/，1997年国家卫生研究院的研究-2005 ）

请注意：我们使用ZEISS AXIOVERT 200M显微镜，蔡司Axiocam MRM单色数码相机和卡尔蔡司Axiovision图像采集软件（4.4版）为活细胞成像。温度控制是通过将保持在30 ° C的PeCon Tempcontrol 37设备由一个加热阶段的幻灯片 。

为了避免再反复调整的重点，这是方便编程的图像采集软件，在每一个时间点自动获取数Z - Stack的图像和装配动画时，请选择最佳的聚焦图像。 一些图像采集软件的自动对焦时间课程实验的选项 。 这是方便使用该选项时可用。

野生型酵母细胞生长最好在30 °彗星，因此温度控制是至关重要的。为了保证足够的热量，这是有助于提供一个外部的热量来源，在加热阶段 。 例如，我们离开对整个工期的成像显微镜传播的白光 。

这也很关键，以避免气泡时准备琼脂糖床和细胞夹心。随着时间的推移加热时，往往以推动细胞成像领域内的气泡夹带的空气膨胀。

同样重要的是，以确保该领域内的单个细胞职位没有变化明显，在成像过程的持续时间，尤其是在试图重新聚焦。 影像稳定器插件是可用的，ImageJ到整顿后的影片已被组装在单元格的位置小变化。 （ http://www.cs.cmu.edu/〜康丽/代码/ Image_Stabilizer.html ）。

Discussion

本协议描述了如何监督的形态学表型蛋白表达（酵母细胞无法进行正常的细胞分裂）后的发展。执行此过程时，重要的是要记住造粒建议离心速度更快的速度可能会损伤细胞和晦涩的结果收获的酵母细胞。应增加活细胞成像前，因为它们是有毒的亚甲基蓝和Calcofluor白色。此过程也可以很容易地适应蛋白质镇压条件下观察到表型的目标是从一个可控的发起人表示。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Nocodazole	Reagent	Sigma-Aldrich	M1404
Methylene Blue 1% (w/v)	Reagent	VWR international	VW6276-0
Calcofluor White	Reagent	Sigma-Aldrich	F3543
Petroleum Jelly	Reagent	VWR international	VW3339-2