Summary
إجراء التسميد
Abstract
دراسة مساهمة جزيئات الموروثة للأمهات لالفقاريات التنمية في وقت مبكر كثيرا ما يصطدم في الوقت والنفقات اللازمة لتوليد الحيوانات الأم وتأثير متحولة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من التقنيات لoverexpress أو تثبيط وظيفة الجينات في الكائنات الحية مثل الضفدع والزرد تفشل بما فيه الكفاية لاستهداف الحرجة الأمهات مسارات الإشارات ، مثل إشارات Wnt. في القيطم ، لا يمكن التلاعب في الجينات وظيفة المثقف والتسميد البويضات في وقت لاحق لهم تخفيف هذه المشاكل إلى حد ما. وdefolliculated يدويا من نسيج المبيض البويضات المانحة ، أو حقن العلاج في الثقافة كما هو مطلوب ، وحفزت ثم مع البروجسترون للحث على النضج. المقبل ، وقدم البويضات في تجويف الجسم لاستضافة الضفدع الإناث البيض ، وعندها سيكون من خلال قناة البيض انهم translocated المضيف والحصول على التعديلات والمعاطف هلام اللازمة للإخصاب. ويمكن عندئذ للأجنة الناتجة يتم رفعها إلى المرحلة المطلوبة وتحليلها عن آثار أي اضطرابات التجريبية. وقد كان هذا الأسلوب المضيف نقل فعالة للغاية في الكشف عن الآليات الأساسية للتنمية في وقت مبكر ، وتتيح مجموعة واسعة من الاحتمالات التجريبية غير متوفرة في أي كائن فقاري النموذج الآخر.
Protocol
1. الجراحية إزالة أنسجة المبيض
- إعداد دفعة جديدة من مستنبت البويضة (OCM ؛ المواد) ، وبين 400-800 مل اعتمادا على حجم التجربة. ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،6-7،8 ، حتى أحمر الفينول يتحول إلى اللون الأحمر الداكن (ستة أو حتى قطرات صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم 5N). أسكب كمية صغيرة للتأكد من درجة الحموضة في أنبوب منفصلة منذ القطب درجة الحموضة قد تلوث وسائل الإعلام. يجب أن يتم تخزين OCM عند 18 درجة مئوية وتستخدم في غضون أسبوع.
- 3-5 حدد والإناث في مكان واحد 2L ~ حل مخدر مخزنة (مواد). نحاول تجنب استخدام الضفادع التي غذيت في يوم أو قبل الجراحة. في حين أن الضفدع هو الاستسلام للتخدير وتطهير المنطقة الجراحية مع EtOH 70 ٪ ، وإعداد الأدوات الجراحية.
- تعقيم الأدوات الجراحية بنسبة 20 في الثانية والانغماس في التعقيم حبة الساخنة في 250 درجة مئوية. الصكوك التالية يجب أن يكون على يد : التعامل مع مشرط (# 3) والنصل (# 10 أو 11) ، وعدة أزواج من ملقط دومون ، بون قزحية المقص (منحني أو مستقيم) ، أو هالسي اولسن - Hegar حامل الإبرة الصغيرة ، وخياطة الجروح. مكان تعقيم الأدوات على طبق بتري معقمة أو في الداخل من حزمة خياطة للحفاظ على العقيمة. فهم إبرة في حامل إبرة في الاتجاه المطلوب قبل بداية. نحن نفضل أصحاب الإبرة اولسن - Hegar منذ يحتوي على مقبض شفرات مقص ، والتي يمكن استخدامها لخفض الغرز دون أدوات التحويل.
- بعد 10 دقيقة ، والتحقق من أنه تم التوصل إلى الطائرة من التخدير الجراحي. وسوف يتوقف عن الحركة تخدير الضفادع وانهم لن يستجيبوا لقرصة أخمص القدمين أو يتم تسليمه. يجب تخدير مشاركة 15 دقيقة ، وهي أكثر من الوقت الكافي لتنفيذ العمليات. ارتداء الملابس الجراحية المناسبة. وهذا يمكن أن تشمل قفازات نظيفة (غير لاتكس) ، والمعاطف مختبر ، والأقنعة الجراحية ، اعتمادا على تفضيل شخصي والمؤسسية المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان.
- مذكرة عن أسلوب العقيم : إفرازات جلد الضفدع تحتوي على الببتيدات المضادة للميكروبات التي تقلل عموما من حدوث التلوث أثناء الجراحة ، على الرغم من ضرورة اتباع الأسلوب العقيم قدر ممكن. ويمكن استخدام الستائر الجراحية ، ولكن قد لا يكون مطلوبا من قبل المؤسسات وIACUCs قد لا توفر الكثير من المنافع. "تقنية معلومات سرية" المستخدمة عموما ، حيث لم تلمس يدي نصائح عقيمة للخياطة الصكوك المادة ، أو موقع شق. يمكن resterilized الصكوك (في جهاز التعقيم حبة) شق التالية من الجلد ، وينبغي الحفاظ على منطقة معقمة على الفوق لوضع الصكوك (مثل طبق بيتري أو حزمة الدرز). المتطلبات المؤسسية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ، لذا يرجى اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسات الخاصة بك وتلقي التعليمات المناسبة لعملية جراحية قبل المنفذ.
- إزالة الضفدع من مخدر ووضعه في الاستلقاء على ظهري جراحية مسح رطبة. المذكرة. ويمكن تنظيف البشرة بواسطة الشطف في اليود povidine المخفف (01:20) أو الكلورهيكسيدين (0.75 ٪). ومع ذلك ، تجنب الدعك الجراحية التجارية ، والصابون ، و 70 ٪ ايزوبروبيل ، وهذه سوف تضر الجلد الحساس من البرمائيات.
- باستخدام مقص القزحية مشرط أو صغيرة ، وجعل الصغيرة (1 -- 1.5 سم) شق في الجلد في الجزء السفلي من البطن والاطراف الى خط الوسط. وينبغي إجراء شقوق اللاحقة على الضفدع نفسه على الجانبين بديل ، متباعدة عن بعضها البعض بشكل جيد. ويمكن إجراء شقوق إما موازية أو عمودية على خط الوسط.
- جعل شقوق الجلد وعضلات البطن على مرحلتين. بعد قطع الجلد ، ورفع طبقة العضلات والمناطق المحيطة لفافة بيضاء اللون مع ملقط وجعل شق في العضلات التي أثيرت. استخدام المقص وخفض على التوالي ، في محاولة لجعل واحدة خفض سريع للكشف عن تجويف الجسم ترك حواف الجرح نظيفا. إذا كان مجرد قطع فآسيا ، وسوف تتراجع ، وسوف تبذل خياطة أكثر صعوبة. ورفع العضلات يساعد على تجنب اصابة أي من أجهزة الداخلية عن غير قصد. أيضا ، في محاولة لتجنب قطع أي طريق القلوب الليمفاوية مرئية أو الأوعية الدموية داخل طبقات العضلات. تمديد فترة مع مقص للشق بحيث يمكن سحبها بسهولة من خلال المبيض.
- وينبغي أن تكون مرئية بوضوح المبيض مرة واحدة يتم إجراء شق. لشراء المبيض ، فهم مع ملقط وعدم استيعاب نسيج المبيض. تتم إزالة المبلغ المطلوب من الأنسجة ، وقلص قبالة على مستوى جدار الجسم. لا الاشياء النسيج مرة أخرى إلى تجويف الجوف العام ، وهذا يمكن أن يكون مصدرا للعدوى أو مضاعفات أخرى.
- نلاحظ فورا قطعة صغيرة من المبيض تحت المجهر تشريح وdefolliculate a البويضات قليلة لاختبار جودتها. ينبغي أن تكون ثابتة وموحدة الحجم والتلوين. إذا كانت مقبولة ، وإزالة المبلغ المطلوب من أنسجة المبيض وخياطة الجرح. ما يكفي لملء 90 مم طبق بتري وعادة ما تكون كافية بالنسبة لمعظم التجارب. إذا كانت هي من نوعية البويضات مشكوك فيها ، خياطة الضفدع وكرر مع امرأة مختلفة.
- إغلاق الشق بواسطة خياطة العضلات وطبقة اللفافة الأولى. ن إدراج eedle بضعة ملليمترات الوحشي على شق ، والتأكد من أن يمر من خلال طبقة اللفافة كذلك. قد الغرز فقط من خلال تمزيق الأنسجة العضلية وتأتي فضفاضة. استخدام ملقط للمساعدة في ادخال الإبرة من أسفل على الجانب الآخر من الشق. إطلاق سراح وإعادة فهم الإبرة من خارج الجسم ، وسحب الخيط حتى من خلال عدة بوصات أو نحو ذلك من الذيل يبقى ، مع الحرص على عدم الانسحاب من كل وسيلة من خلال.
- إغلاق الجرح مع نمط بسيط للخياطة توقف. نستخدم التعادل أداة أساسية لجعل عقدة الجراح مربع (عقدة شراع). حلقة نهاية الطويل للخياطة في جميع أنحاء حامل الإبرة ، فهم الذيل وتسحبه من خلال حلقة تجاهك وإحكام. والجذب من خلال حلقة مرة أخرى ، هذه المرة سحب حامل الإبرة بعيدا عنك. ويمكن استخدام رمي الثالث للأمن وأضاف (في نفس اتجاه الأول). تقليم الخيط ، وترك الذيل القصير وتفعل شيئا آخر غرزة في العضلات مليمترات قليلة. اثنين من خيوط كافية لخياطة الجروح الصغيرة ، وثلاثة للحصول على أكبر حجما. تكرار للطبقة الجلد. مظاهرات تقنية الفيديو خياطة الأساسية متاحة على موقع يوتيوب -- ابحث عن "صك التعادل" ، وهناك عدد غير قليل للاختيار من بينها ، على الرغم من أن الأسلوب الأساسي هو نفسه.
- شطف الأنثى مع الماء منزوع الأيونات ومكانها في دلو مليء الانتعاش بارد (18 درجة مئوية) المياه. بينما في المختبر ، ويتم الاحتفاظ الضفادع في مياه الحنفية تعامل مع Amquel لإزالة الكلورامينات. كل بضع دقائق ، ورفع بلطف الضفدع من المياه والبحث عن الإبتلاع أو حركات العين المنتفخة ، مما يدل على التعافي من التخدير.
- ملاحظة : الجراحة البقاء على قيد الحياة وليس من الضروري تماما للحصول على أنسجة المبيض ، على الرغم من أن الإناث ستواصل انتاج البويضات جيدة بعد عدد من العمليات. والمنفذ لعملية جراحية بقاء أيضا قطع الخناق على أعداد الحيوانات المستخدمة. يجب التأكد من اتباع المبادئ التوجيهية وحدتك رعاية الحيوانات الفقارية على أساليب الجراحة البقاء ، والرعاية بعد العملية والرصد وعمليات جراحية لعدد من المسموح به على الفرد.
2. زراعة البويضات وDefolliculating
- مباشرة بعد الانتهاء من الجراحة ، وتقسيم المبيض إلى قطع صغيرة (~ 2 سم 2) وتخزينها في OCM الطازجة ، وذلك باستخدام قطعة في صحن 5-6 مم 90. تقطع فصوص الفردية المبيض مفتوحة ، بالارض خارج ومقطعة إلى قطع مربعة. وتشطف في هذه OCM نظيفة ووضعها في أطباق للثقافة. وتسطيح وتقسيم المبيض تمديد الحياة في الثقافة وجعل defolliculation أسهل.
- نقل إلى الفص طبق صغير من OCM وdefolliculate يدويا 300-500 البويضات. نقل البويضات باستخدام العقيمة ، والحرائق مصقول ماصة. لقد وجدنا أن استخدام مجموعة متنوعة من القطن توصيل ضرورية للحد من التلوث من الثقافات. تخزين البويضات عند 18 درجة مئوية في OCM مل 8 (في أطباق المتوسطة (فالكون 1007)) في مجموعات من 100-150. مع الممارسة ، يجب أن تكون قادرة على defolliculate البويضات كافية في 1-2 ساعات. Collagenased البويضات ليست مناسبة لنقل المضيف نظرا لأنها لا تكون fertilizable.
- Defolliculating الأسلوب. نحن defolliculate باستخدام الملقط الساعات "(دومون 4S # # أو 5S ، وأدوات العلوم الجميلة) ، وفقا للأساليب الأساسية المبينة في سميث وآخرون ، (1991). زوج واحد من استخدام ملقط (في يدك المهيمنة) ، فهم طبقة القراب النسيج الضام المحيطة المرحلة السادسة بالكامل نمت بالقرب من البويضة حيث يتم إرفاق جريب للمبيض (ساق). مع زوج آخر من الملقط ، فهم المبيض المتاخمة للزوج الأول. المسيل للدموع طبقة خفيفة فتح المسام عن طريق سحب عبر البويضة. ندف بلطف البويضة من الأنسجة. البويضات defolliculated بنجاح يتم سحب البويضات من floppier ببساطة من دون إزالة الطبقة جريب ، وسوف يكون خاليا من الأوعية الدموية وضوحا.
- ملاحظة : من الضروري للحفاظ على ضغط خفيف جدا على نصائح من ملقط ، وهو ما يكفي بالكاد لتلبية نصائح. تجتاح مسرف هو مشترك بين مبتدئين ، وسوف ينتج بويضة يتم سحبها بعيدا مع جريب سليمة. الحفاظ على زوج جيد من ملقط حصرا لdefolliculating. ينبغي أن تفي بدقة ونصائح ينبغي قليلا من أشد فظاظة ملقط لصنع explants من أجنة القيطم (الشكل 1).
- نحن اختبار روتيني حوالي 20 ناضجة مع البروجسترون وإجهاض التجربة إذا كان معدل نضوج غير الفقراء (<50 ٪ بعد 6-7 ساعات في درجة حرارة الغرفة).
- عند هذه النقطة ، يمكن التلاعب البويضات والمثقف كما هو مطلوب ، مثل microinjection من جزئية ، أو morpholino مرنا. إجراءات حقن تختلف في المختبر ، لذلك نحن لن وصف تلك هنا. يمكن الحفاظ على البويضات تصل إلى أسبوع في OCM ، ولكن عموما صحة الانخفاضات لذلك فمن الأفضل لاستخدامها لنقل في غضون 96 ساعة من العزلة.
- نأخذ في الاعتبار أنه لا يمكن نقل سوى خمس إلى ست مجموعات (بما في ذلك السيطرة) لامرأة واحدة ، وذلك بسبب القيود المفروضة على الأصباغ الحيوية ، ذلك خطة التجارب وفقا لذلك.
- إذا كان أداء الانقاذ استنفاد بنسبة ضئيلة ، وضخ مرنا الخاص بك (عادة 5-30 جزء من الغرام من الحمض النووي الريبي) ~ 24-48 ساعة بعد بنسبة ضئيلة. سوف يكون oligos المتدهورة قبل هذا الوقت وينبغي ألا تؤثر على الحمض النووي الريبي حقن.
- في مساء يوم قبل إجراء عملية النقل ، إضافة 16 ميكرولتر من محلول البروجسترون العمل (1MM في EtOH) إلى البويضات في OCM مل 8 في أطباق المتوسط (نهائي تركيز هرمون البروجسترون هو ~ 2 ميكرومتر). احتضان 10-12 ساعة عند 18 درجة مئوية للسماح للنضوج البويضة.
- حقن 3-5 الإناث مع 1000 وحدة في الضفدع من قوات حرس السواحل الهايتية للحث على وضع البيض. تجاربنا يبدو للعمل بشكل أفضل اذا ما تم نضوج البويضة وحقن قوات حرس السواحل الهايتية في نفس الوقت تقريبا ، على بعد حوالى 12 ساعة قبل الزرع في المضيف (على سبيل المثال ، 22:00 صباحا -10). ترك الإناث عند RT أو 18 درجة مئوية خلال الليل.
4. إعداد وتلوين حيوي صبغ من البويضات
- في صباح يوم من النقل ، تسمح ~ 45-60 "لإعداد وتنفيذ الإجراء. عند هذه النقطة ، يمكن تجميد البويضات الناضجة لتحليلها في وقت لاحق من فعالية ضربة قاضية مرنا أو تعبير البروتين. أيضا ، تأكد من أن البويضات لم يصابوا ، وأنه كانت هناك نسبة جيدة النضج (> 50 ٪). سوف لا يخصب البويضات المصابة. ذوبان الأصباغ الحيوية (المواد) ، وتدور بسرعة قصوى لمدة 5 دقائق.
- لون مختلف المجموعات التجريبية وذلك بإضافة 80 ميكرولتر صبغة الحيوية المناسبة (ق) الى أطباق واحتضان البويضة مع هزاز لمدة 15. خلال هذا الوقت ، حدد الأنثى المضيفة ويبدأ التخدير. اختيار الضفادع التي يتم وضع البيض عادة ببطء أو تلك التي تنتج البيض وفيرة مع الضغط الخفيف. وينبغي أن البيض من المضيف تكون ذات نوعية جيدة. تجنب الإناث التي يتم وضع سلاسل من البيض أو البيض سحقهم.
- نقل البيض الملون إلى طبق كبير من OCM العذبة ، ودوامة لفترة وجيزة أن تغسل وتوضع جانبا قبل نقلها.
- إعداد ماصة باستير العقيمة مع تتحمل واسعة بما يكفي لاستيعاب بويضة (~ 1.5 مم) لاستخدامها في زراعة البويضات. يسجل ماصة مع قلم الماس وكسر نظيفة. تلميع النار حتى حواف ناعمة ، مع الحرص على عدم الذوبان في افتتاح مغلقة.
5. أداء زرع سيت
- زرع البويضة يستخدم نفس الإجراءات الجراحية كما هو موضح في الجزء الأول ، على الرغم من أن بدلا من إزالة المبيض ، وعرض البويضات التلاعب في تجويف الجسم مع ماصة. من الناحية المثالية ، ينبغي أن يتم تنفيذ الإجراء نقل بأسرع ما يمكن ، وينبغي أن يظل حجم الفتحة صغيرة بقدر الإمكان.
- Anesthesize الأنثى المضيفة وإعداد الأدوات الجراحية كما هو موضح في الجزء الأول وجعل شق كما هو موضح في الجزء الأول ويمكن شق أصغر ، لكنه يحتاج إلى أن تكون كبيرة بما يكفي لتناسب الفتحة ماصة للنقل (الشكل 2A).
- لزرع البويضات ، ورفع قبضة one رفرف العضلات واللفافة مع ملقط وإدخال التجريبية البويضات باستخدام ماصة باستير أعد أعلاه. دوامة طبق من البويضات لجمعها في الوسط وامتصاص أكبر عدد ممكن. السماح للبويضات لتسوية في نهاية ماصة لمنع السائلة الزائدة من يجري إدخال وإدراج غيض من ماصة في شق والسماح ببطء البويضات في التوافد الى تجويف الجسم (الشكل 2B). تكرار حتى يتم نقل جميع البويضات. لا افراج عن طبقة العضلات في أي وقت ، حتى يكون لديك بدأت خياطة ، أو البويضات سوف تمتد من شق.
- بمجرد أن يتم نقل البويضات ، فهم كلا الجانبين من شق مع ملقط والجمع بينها ، والسماح للبويضات ليستقر في تجويف الجسم. يبدأ خياطة كما هو موضح ، مع الحرص على إبقاء التوتر التصاعدي على العضلات واللفافة حتى يتم عقد قرانه الأول (الشكل 2C). هذا وسوف تبقي على البويضات من طرده خارج ، وسيسمح للحواف شق للشفاء بشكل متساو. إضافة آخر غرزة في طبقة العضلات / اللفافة ثم خياطة الجلد.
- شطف الأنثى مع الماء منزوع الأيونات ومكانها في دلو مليء الانتعاش تبريد المياه المعالجة Amquel (18 درجة مئوية). رصد شفائها من التخدير على النحو الوارد أعلاه. فهل يبدأ وضع البيض عادة بعد العملية.
- الحصول على الخصيتين من الضفادع الذكور باستخدام الإجراءات العادية. تخزين أو الخصيتين في OCM L15 لحين الحاجة إليها. نحن نفضل الخصية جديدة عندما نقل تجارب التسميد.
6. الانتعاش من البويضات في المختبر والتسميد
- وأهداب البريتوني محرك نقل البيض (بيض والجوف العام العادي للمضيف) إلى فتحات ناقلة البيضات في الجزء الأمامي من تجويف الجسم. يمكن استرداد البيض الملون بداية 2-3 بعد ساعات من نقل عن طريق الضغط العادي. ويمكن الحصول على البيض كل نصف ساعة أو نحو ذلك حتى توقف عن وضع النساء.
- إخصاب في جمعية مهندسي البترولRM التعليق (في ~ 4 MMR 1X مل) لمدة 4 دقائق. الفيضانات وشطف نطاق واسع مع 0.1x MMR. وينبغي تفعيل البيض بشكل طبيعي وسوف تبدأ في ساعة يلتصق 1،5-2 ~ بعد الإخصاب. وغالبا ما تنقل يلتصق البيض في وقت لاحق قليلا من البيض المضيف.
- إزالة هلام المعاطف مع السيستين وأجنة طبيعية والفرز في أطباق منفصلة. يمكن القيام بذلك في أي مرحلة ، اعتمادا على احتياجات التجربة. من الأسهل عادة لتحديد ألوان مختلفة حول المرحلة 4 - الخلية وأصعب مراحل الأريمة في وقت متأخر. ثقافة البيض في مناطق ذات كثافة منخفضة (<50 في صحن المتوسطة) في لقاح MMR 0.1x نظيفة. من هذه النقطة ، يمكن علاج الأجنة والتلاعب بها عادة.
- عودة إلى مرفق الضفادع الحيوانية ورصد لمضاعفات خلال الايام القليلة المقبلة.
- أسلوب بديل الإخصاب ؛ وضع البيض في مخزن الملح
- بعد الضفدع تعافى من التخدير ، ومكانها في MMR ~ عالية من الملح 1L (1.2x). السماح للنساء لوضع البيض في المخزن المؤقت لحوالي 4-6 ساعات. أزمة البيض المتبقية خارج ، واستنزاف MMR 1.2x وفرز البيض الملون في صحن نظيف ، وإزالة جميع سائل ممكنة.
- غسل نطاق واسع مع 0.3x MMR وتخصيبها في حجم الحد الأدنى من تعليق MMR / الحيوانات المنوية 0.3x حتى البيض تنشيط (10 دقيقة). الفيضانات مع MMR 0.1x والثقافة على النحو الوارد أعلاه. هذا الخيار مفيد إذا كان هناك حاجة إلى الكثير من البيض في نفس المرحلة أو إذا كان التعبير المستعمل من البيض يضر البويضات المانحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك نتيجة ناجحة في نقل الإخصاب والانقسام الطبيعي 50 ٪> من البويضات (الشكل 3). وعموما بين 30-60 ٪ من البويضات نقل البقاء على قيد الحياة في المراحل الماضية neurula. نحن عادة 75-150 نقل البويضات في المجموعة التجريبية ، والتي سوف تسفر الأجنة ما يكفي لعدة أنواع من التحليل (في الموقع ، RT - PCR) ، وكذلك الرؤية والنمط الظاهري. زرع البويضات أكثر بكثير لا يبدو أن زيادة كبيرة في المحصول. أيضا ، يجب نقل ما لا يقل عن 30 البويضات في المجموعة ليضمن على الأقل بعض من خلال جعلها تكون المعيدة. الأصباغ الحيوية عموما لا تؤثر على الأجنة في ظل ظروف وصفها تركيزات هنا ، على الرغم من أن الأصباغ قد يكون لها آثار سلبية في بعض الحالات. تقليديا ، تم الإبلاغ عن متعادلة الأحمر لها خصائص الضوئية عند التعرض لضوء ساطع على مصادر قوية. في الآونة الأخيرة ، أفادت وHeasman مير (2008) أن بسمارك براون يمكن أن يكون بعض الآثار السمية إذا حضنت الأجنة في درجات حرارة منخفضة. وينبغي أن الاحتياطات الأساسية مثل عدم الموت البويضات بشكل مفرط وتجنب التطرف في درجات الحرارة والإضاءة القضاء على إمكانية الحيوية آثار جانبية صباغة.
أكبر العوامل في نجاح أو فشل الأسلوب ونوعية البويضات المانحة والمضيفة للإناث. لا توجد طريقة مضمونة لتحديد ما إذا كانت الدفعي معين من البويضات وتخصيبها بشكل جيد. وينبغي تجنب المبيض مع نسبة عالية من البويضات رتقي. أيضا ، لقد حققنا نجاحا مع الفقراء المبيض الذي أوعية دموية بشدة ، مشيرا إلى أنه ربما يحدث ارتشاف. يجب أن تبقى البويضات عند 18 درجة مئوية قدر المستطاع وأبقى على خلاف ذلك في حالة صحية جيدة وسوف لا إخصاب البويضات إذا ما أصيبوا أو أصيبت بأضرار. ويبدو أيضا ، في المختبر ، أن يتم تحقيق نتائج أفضل عند defolliculator هو أكثر خبرة ، ويمكن عزل وحقن عدد كبير من البويضات في فترة زمنية قصيرة. وبالمثل ، يجب الحرص على اختيار يستضيف صحية مع البيض ، على الرغم من انها ليست ابدا على يقين بأن الضفدع إذا توفرت الإرادة جعل مجموعة جيدة. كما هو الحال مع defolliculating ، ومهارة الجراح لها ايضا تأثير على نجاح العملية. تقليل طول الوقت anesthesized المضيف يبدو حاسما لاستعادة كفاءة والتسميد.
توقيت الشاملة لمختلف الإجراءات أمر بالغ الأهمية لنجاح تجارب نقل البويضة. بشكل عام ، يتم الاحتفاظ في أقصر وقت البويضات في الثقافة ، وسوف التسميد أفضل عموما وصحة الأجنة يكون. ضربة قاضية للتجارب باستخدام مرنا oligos العقاقير ، ينبغي مثقف البويضات لا يقل عن 24 ساعة بعد الحقن بنسبة ضئيلة للسماح لاستنفاد الحد الأقصى من الهدف ومرنا للدوران بنسبة ضئيلة. وبالتالي يجب أن defolliculated البويضات في أقرب وقت ممكن ، وحقن في اليوم نفسه. تجربة نموذجية قد تبدأ يوم الاثنين مع العزلة البويضة وحقن ، تليها النضج وتحفيز الإناث مساء الثلاثاء ، ونقل صباح اليوم الاربعاء. إذا كان الهدف هو الحمض النووي الريبي دوران بطيء أو أن هناك وفرة البروتين الأمهات ، ويمكن تمديد الفترة إلى 48 ثقافة أو حتى 72 ساعة. لدينا أفضل النجاح عندما يتم نقل البويضات في غضون 12 ساعة من العلاج مع البروجسترون. الإفراط في البويضات الناضجة وتبدأ في التدهور يخصب عموما سيئة. نضيف عموما البروجسترون وحقن الإناث مع قوات حرس السواحل الهايتية حوالي 12 ساعة قبل تنفيذ عملية النقل ، مع كل من البويضات والضفادع يحتفظ بها في ~ 18 درجة مئوية خلال الليل.
على الرغم من أن أسلوب نقل المضيف إلى عمالة كثيفة في البداية ، يمكن الحصول على المهارات الأساسية اللازمة دون صعوبة كبيرة. الاستخدام الأكثر شيوعا لهذا الأسلوب هو لتخصيب البويضات التي تم المنضب من mRNAs الأمهات محددة عن طريق الحقن قليل النوكليوتيد العقاقير. ويمكن أيضا معالجات أخرى مثل overexpression مرنا أو العلاج بالعقاقير يتعين القيام بها. يمكن لهذه غالبا ما يكون مقارنة مع نتائج مختلفة الإخصاب بالحقن التالية ، وذلك بسبب زيادة في التعبير أو وظيفة الفرق في البيض مقابل الأجنة. تشعيع E - كادهيرين overexpression (Heasman وآخرون ، 1991). والأشعة فوق البنفسجية (Holwill وآخرون ، 1987 ؛. Elinson وPasceri ، 1989) هما مثالان للاهتمام. النتائج الاولية من مختبر لدينا تشير أيضا إلى أن أساليب transgenesis استخدام حقن أو integrase meganucleases قد تعمل بشكل أكثر كفاءة في البويضات كذلك.
تقنية نقل المضيف يسمح التجريب في كل من المراحل قبل وبعد الإخصاب ، وبالتالي يمكن أن تقدم أفكارا غير ممكن في الكائنات الحية الأخرى أو حتى من خلال النظر فقط في ما بعد الإخصاب الأحداث في القيطم. نظرا لأهمية الأمهات مسارات إشارات في التنمية ، وصعوبة وتكلفة توليد الطفرات تأثير الأمهات في الفقاريات ، وهذه الطريقة من المرجح أن تظل أداة مفيدة في تحقيق التنمية في وقت مبكر.
7. ممثل الدولةsults
الشكل 1. أمثلة على ملقط (القاع) جيدة (الأعلى) ، وسيئة بالنسبة defolliculating.
الشكل 2. نقل البويضات في الإناث مثقف المضيف (A) يتم إجراء شق صغير في أسفل البطن من الضفادع المضيف. هو ارتفاع طبقة العضلات قليلا للسماح بإدخال البويضات. (ب) البويضات حيوية مصبوغ وضعها في تجويف الجسم من خلال شق. (ج) الانتهاء من خياطة الأولية في طبقة العضلات.
الشكل 3. أمثلة للتقسيم ، نقل البويضات في مرحلة 8-16 خلايا ، بعد إزالة هلام المعاطف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة أيوا IACUC اللجنة.
Acknowledgments
فإن مثل كتاب شكر لأعضاء المختبر هيوستن لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم البحث من المعاهد الوطنية للصحة (GM083999) منحت لDWH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and recipes: | |||
| OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996) | |||
| 70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine) | Invitrogen | 11415-064 | |
| 0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V) | Sigma-Aldrich | A-9418-50g | |
| 1x Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P-0781 | |
| Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH | |||
| Make fresh weekly, store at 18°C. | |||
| 10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998) | |||
| 1M NaCl | |||
| 20 mM KCl | |||
| 20 mM CaCl2 | |||
| 10 mM MgCl2 | |||
| 150 mM HEPES | |||
| adjust to pH 7.6-7.8 | |||
| Store at 4°C | |||
| Anesthetic solution | |||
| 1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| 0.7 g/L sodium bicarbonate | |||
| Dissolve in Amquel-treated water | |||
| Make fresh weekly | |||
| Progesterone stocks | |||
| 10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol | |||
| Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution | |||
| Store at -20°C | |||
| Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991) | |||
| Blue: 0.1% Nile Blue A | Aldrich | 121479-5G | |
| Red: 0.25% Neutral Red | Sigma-Aldrich | N-6634 | |
| Brown: 1% Bismarck Brown | Sigma-Aldrich | B-2759 | |
| Green (80 μl blue + 80 μl brown), | |||
| Mauve (80 μl blue + 80 μl red). | |||
| A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown. | |||
| Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C. | |||
References
- Brun, R. Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis. Experientia. 31, 1275-1276 (1975).
- Elinson, R. P., Pasceri, P. Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos. Development. 106, 511-518 (1989).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro. Development. 100, 735-743 (1987).
- Houston, D. W., King, M. L. A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus. Development. 127, 447-456 (2000).
- Mir, A., Heasman, J. How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique. Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).
- Rugh, R. Experimental Embryology: Techniques and procedures. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).
- Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles. Dev Biol. 17, 627-643 (1968).
- Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. Oogenesis and oocyte isolation. Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).
- Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos. Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).
- Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos. Development. 122, 2987-2996 (1996).
- Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos. Cell. 94, 515-524 (1998).
- Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).
