Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Summary

Procedura per la concimazione

Abstract

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l'ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L'host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

Protocol

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell'ovaio

1. Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell'esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l'elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro una settimana.
2. Seleziona 3-5 femmine e posto uno in ~ 2L soluzione tamponata anestetico (Materiali). Cerchiamo di evitare di usare le rane che sono stati alimentati il ​​giorno o prima di un intervento chirurgico. Mentre la rana è cedere alla anestetico, disinfettare l'area chirurgica con il 70% EtOH e preparare gli strumenti chirurgici.
3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici da parte di 20 secondi l'immersione in uno sterilizzatore a caldo cordone a 250 ° C. I seguenti strumenti dovrebbero essere a portata di mano: manico bisturi (# 3) e la lama (# 10 o 11), diverse paia di Dumont pinze, forbici iris Bonn (curve o diritte), Halsey o Olsen-Hegar titolare micro aghi e suture. Luogo sterilizzati strumenti su piastra di Petri sterile o all'interno del pacchetto di sutura per tenere sterile. Afferrare l'ago nel porta-aghi con l'orientamento desiderato prima di iniziare. Noi preferiamo Olsen-Hegar porta-aghi in quanto il manico contiene lame a forbice, che può essere usato per tagliare suture senza strumenti di commutazione.
4. Dopo 10 minuti, verificare che un aereo di anestesia chirurgica è stato raggiunto. Rane anestetizzato smetterà di muoversi e non risponde a un pizzico piedi o di essere capovolta. Anestesia dovrebbe durare 15 minuti, che è più che abbastanza tempo per eseguire le operazioni. Don abbigliamento adeguato chirurgico. Questo può includere guanti puliti (non-lattice), camici e mascherine chirurgiche, a seconda delle preferenze personali e istituzionali le linee guida la cura degli animali.
5. Nota sulla tecnica asettica: le secrezioni della pelle Frog contengono peptidi antimicrobici che in genere riducono l'incidenza di contaminazione durante l'intervento chirurgico, anche se la tecnica asettica deve essere seguita il più possibile. Teli chirurgici può essere utilizzato, ma non può essere richiesto da IACUCs istituzionali e non può fornire molto beneficio. Generalmente "tecnica punta" usato, dove le mani toccano le punte sterili del, materiale di sutura strumenti o sito di incisione. Gli strumenti possono essere risterilizzati (nello sterilizzatore tallone) incisione a seguito della pelle, e una zona sterile dovrebbe essere mantenuta sul bancone per gli strumenti che mette (come una capsula di Petri o un pacchetto di sutura). Requisiti istituzionali possono differire in modo significativo, quindi seguire le linee guida le vostre istituzioni 'e di ricevere adeguate istruzioni prima di eseguire interventi chirurgici.
6. Rimuovere la rana da anestetico e posto in decubito dorsale su un chirurgico umido pulire. Nota. La pelle può essere pulito con il risciacquo di iodio povidine diluito (1:20) o clorexidina (0,75%). Tuttavia, evitare commerciale scrub chirurgico, saponi e il 70% di alcol isopropilico, poiché possono danneggiare la pelle delicata di anfibi.
7. Usando un bisturi, forbici o piccoli iris, fare un piccolo (1 - 1,5 cm) incisione nella pelle nella parte inferiore dell'addome, laterale alla linea mediana. Incisioni successive sulla stessa rana deve essere eseguita su lati alterni, ben distanziati gli uni dagli altri. Le incisioni possono essere effettuate sia parallela o perpendicolare alla linea mediana.
8. Rendere la pelle e le incisioni dei muscoli addominali in due fasi. Dopo il taglio della pelle, sollevare lo strato muscolare e circonda di colore bianco fascia con una pinza e fare l'incisione nel muscolo sollevato. Usare le forbici e tagliare verso il basso, cercare di fare un taglio rapido per esporre le cavità del corpo lasciando margini della ferita pulita. Se solo la fascia è tagliata, si rientra e renderanno più difficile la sutura. Sollevare il muscolo evitare inavvertitamente ferire qualsiasi organi interni. Inoltre, cercare di evitare il taglio tramite qualunque cuori linfatici visibili o vasi sanguigni all'interno degli strati muscolari. Estendere la lunghezza con le forbici del taglio in modo che ovaie possono essere facilmente tirato attraverso.
9. Ovaio deve essere chiaramente visibile una volta che l'incisione viene fatta. Per procurarsi i ovaio, afferrare con una pinza e esternare il tessuto ovarico. La quantità desiderata di tessuto viene rimosso e rifilata a livello della parete del corpo. Non roba del tessuto indietro nella cavità celomatica, in quanto ciò potrebbe essere fonte di infezioni o altre complicazioni.
10. Subito osservare un piccolo pezzo di ovaio sotto un microscopio da dissezione e defolliculate uno ovociti pochi per testare la loro qualità. Essi dovrebbero essere fermi e di dimensioni uniformi e colorazione. Se sono accettabili, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico e suturare l'incisione. Abbastanza per riempire un 90 millimetri piatto di Petri è solitamente sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Se gli ovociti sono di qualità discutibile, sutura la rana e ripetere con una donna diversa.
11. Chiudere l'incisione di sutura il muscolo e lo strato prima fascia. Inserire il n eedle pochi millimetri laterale per l'incisione, avendo cura di passare attraverso lo strato di fascia pure. Suture solo attraverso il muscolo può strappare il tessuto e allentarsi. Usare pinze per inserire l'ago da sotto sul lato opposto della incisione. Rilascio e ri-comprendere l'ago dall'esterno del corpo e tirare la sutura attraverso fino a diversi centimetri o giù di lì della coda rimane, facendo attenzione a non tirarlo fino in fondo.
12. Chiudere la ferita con un semplice modello interrotto di sutura. Usiamo un legame fondamentale strumento per rendere chirurgo nodi quadrati (nodi scogliera). Anello l'estremità lunga della sutura intorno al titolare ago, afferrare la coda e tirarlo attraverso il ciclo verso di voi e stringere. Loop e tirare attraverso, questa volta tirare il titolare ago lontano da voi. Un terzo lancio può essere utilizzato per una maggiore sicurezza (nella stessa direzione del primo). Tagliare la sutura, lasciando la coda corta e farne un'altra sutura nel muscolo pochi millimetri di distanza. Due punti di sutura sono sufficienti per piccole suture, tre per quelle più grandi. Ripetere l'operazione per lo strato di pelle. Dimostrazioni video della tecnica di sutura di base sono disponibili su YouTube - la ricerca di "legare strumento", ci sono un bel po 'tra cui scegliere, anche se la tecnica di base è la stessa.
13. Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero fresco (18 ° C). Mentre in laboratorio, le rane sono tenuti in acqua di rubinetto trattata con Amquel per rimuovere clorammine. Ogni pochi minuti, sollevare delicatamente la rana dall'acqua e cercare ingoiare o occhi sporgenti movimenti, indicative di ripresa dall'anestesia.
14. Nota: Chirurgia La sopravvivenza non è strettamente necessario per ottenere tessuto ovarico, anche se le femmine continuerà a produrre ovociti buoni dopo un certo numero di operazioni. L'esecuzione di interventi chirurgici sopravvivenza anche ridurre il numero degli animali utilizzati. Assicurati di seguire le linee guida dell'unità di cura degli animali sui metodi di vertebrati chirurgia sopravvivenza, post-op cura e monitoraggio e per numero di interventi chirurgici ammessi su un individuo.

2. Coltura e oociti Defolliculating

1. Subito dopo l'intervento è terminato, suddividere l'ovaio in piccoli pezzi (circa 2 cm ²⁾ e conservare in OCM fresco, con 5-6 pezzi al piatto 90 mm. Lobi individuali di ovaio vengono tagliati aperti, appiattita e tagliate a pezzi quadrati. Questi sono risciacquati in OCM pulito e messo in piatti per la cultura. Appiattimento e dividendo l'ovaio estenderà la sua vita di cultura e di rendere più facile defolliculation.
2. Spostare un lobo di un piccolo piatto di OCM e manualmente defolliculate 300-500 ovociti. Ovociti mediante trasferimento sterile, fuoco lucido pipetta. Abbiamo scoperto che utilizzando il cotone collegato varietà è essenziale per minimizzare la contaminazione delle culture. Conservare gli ovociti a 18 ° C in 8 mL OCM (in piatti di media (Falcon 1007)) in gruppi di 100-150. Con la pratica, si dovrebbe essere in grado di defolliculate ovociti abbastanza in 1-2 ore. Ovociti Collagenased non sono adatti per il trasferimento di ospitare in quanto non è fertilizable.
3. Defolliculating metodo. Noi defolliculate con pinze (Dumont o # # 4s 5s, Strumenti Scienza Fine) orologiai ', seguendo i metodi descritti in base Smith et al., (1991). Utilizzando un paio di pinze (in mano dominante), afferrare la teca strato di tessuto connettivo che circonda un adulto ovocita VI tappa vicino a dove il follicolo è collegato l'ovaio (il gambo). Con l'altra coppia di pinze, afferrare l'ovaio adiacente alla prima coppia. Leggermente lacerare lo strato follicolo tirando attraverso l'ovocita. Delicatamente stuzzicare l'ovocita fuori del tessuto. Ovociti con successo defolliculated sono floppier di ovociti semplicemente tirato fuori senza rimuovere lo strato follicolo e sarà priva di vasi sanguigni visibili.
4. Nota: E 'essenziale per mantenere la pressione molto leggera sulle punte della pinza, appena sufficiente per le punte di incontrare. Serraggio troppo stretto è un comune tra i principianti e comporterà l'ovocita di essere tirato via con il follicolo intatto. Mantenere un buon paio di pinze in esclusiva per defolliculating. Le punte devono soddisfare in modo preciso e dovrebbe essere leggermente più schietto pinze per fare espianti da embrioni di Xenopus (Figura 1).
5. Noi abitualmente prova matura circa 20 con progesterone e interrompere l'esperimento se il tasso di maturazione è scarsa (<50% dopo 6-7 ore a temperatura ambiente).
6. A questo punto, gli ovociti possono essere manipolati e colto come desiderato, come la microiniezione di oligo, morfolino o mRNA. Procedure di iniezione variare in base alla laboratorio, in modo da non descrivere quei qui. Ovociti può essere mantenuta fino a una settimana di OCM, ma in generale la salute declina quindi è meglio usarli per il trasferimento entro 96 ore di isolamento.
7. Tenete presente che solo cinque a sei gruppi (tra cui un controllo) possono essere trasferiti su una singola femmina, a causa di limitazioni di coloranti vitali, in modo da pianificare la sperimentazione di conseguenza.

"> 3. Maturazione degli ovociti e la stimolazione di femmine ospitanti

1. Se si esegue un salvataggio di esaurimento oligo, iniettare il mRNA (di solito 5-30 pg di RNA) ~ 24-48 ore dopo l'oligo. L'oligo avrà degradata da questo momento e non dovrebbe incidere sulla RNA iniettato.
2. La sera prima di eseguire il trasferimento, aggiungere 16 ml di soluzione di progesterone di lavoro (1 mm di EtOH) di ovociti in 8 OCM mL in piatti di mezzo (concentrazione di progesterone finale è ~ 2 mM). Incubare per 10-12 ore a 18 ° C per consentire la maturazione degli ovociti.
3. Iniettare 3-5 femmine con 1000 unità per rana di hCG per indurre la deposizione delle uova. I nostri esperimenti sembrano funzionare meglio se la maturazione degli ovociti e l'iniezione di hCG sono fatte nello stesso periodo, circa 12 ore prima dell'impianto nell'ospite (ad esempio, 22:00 AM -10). Lascia femmine a RT o 18 ° C durante la notte.

4. Preparazione e colorazione colorante vitale di ovociti

1. La mattina del trasferimento, permettono ~ 45-60 'a impostare ed eseguire la procedura. A questo punto, gli ovociti maturi possono essere congelati per una successiva analisi dell'efficacia del knockdown mRNA o espressione della proteina. Inoltre, controllare che gli ovociti non sono stati infettati e che c'era un buon tasso di maturazione (> 50%). Ovociti infetto non si fecondano. Scongelare coloranti vitali (Materiali) e far girare a velocità massima per 5 min.
2. Colori diversi gruppi sperimentali con l'aggiunta di 80 ml di colorante appropriato vitale (s) ai piatti ovocita e incubare con dondolo per 15 '. Durante questo periodo, selezionare una femmina ospite e iniziare l'anestesia. Scegli una rana che sta lentamente le uova in modo normale o quella che produce le uova con abbondante spremitura mite. Uova dal host deve essere di buona qualità. Evitare di femmine che gettano le stringhe di uova o uova schiacciati.
3. Trasferire le uova colorate di un grande piatto di OCM fresca, agitare brevemente di lavare e metterle da parte prima del trasferimento.
4. Preparare una pipetta Pasteur sterile, con un alesaggio ampio abbastanza da ospitare un ovocita (~ 1,5 mm) per l'utilizzo in trapiantare gli ovociti. Punteggio ottenuto la pipetta con una matita diamante e rompere pulito. Fuoco fino a lucidare i bordi sono lisce, facendo attenzione a non sciogliere l'apertura.

5. L'esecuzione del trapianto degli ovociti

1. Trapianto ovocita utilizza le stesse procedure chirurgiche, come descritto nella parte I, anche se invece di rimuovere ovaie, gli ovociti vengono manipolati inserito nella cavità del corpo con una pipetta. Idealmente, la procedura di trasferimento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la dimensione dell'incisione deve essere mantenuto il più piccolo possibile.
2. Anesthesize la femmina ospite e preparare gli strumenti chirurgici, come descritto nella parte I. Marca e incisione, come descritto nella parte I. L'incisione può essere più piccolo, ma deve essere grande abbastanza da contenere il foro della pipetta di trasferimento (Figura 2A).
3. Per il trapianto di ovociti, afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia con una pinza e introdurre gli ovociti sperimentale utilizzando la pipetta Pasteur preparato in precedenza. Agitare il piatto di ovociti per raccoglierli nel centro e succhiare il maggior numero possibile. Lasciare gli ovociti di stabilirsi nella fine della pipetta per evitare che il liquido in eccesso di essere introdotto e inserire la punta della pipetta in incisione e lentamente permettere gli ovociti di filo nella cavità del corpo (Figura 2B). Ripetere fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti. Non rilasciare lo strato muscolare in qualsiasi momento, fino a quando non hanno iniziato sutura, o gli ovociti saranno fuoriuscite di incisione.
4. Una volta che gli ovociti sono stati trasferiti, afferrare entrambi i lati della ferita con una pinza e metterli insieme, permettendo al ovociti di stabilirsi nella cavità del corpo. Iniziare la sutura come descritto, avendo cura di mantenere la tensione verso l'alto sul muscolo e fascia fino al primo nodo è legato (Figura 2C). Ciò manterrà gli ovociti di essere espulsi e consentirà ai bordi della ferita per guarire in modo uniforme. Aggiungere un altro sutura nel muscolo / fascia livello e poi sutura la pelle.
5. Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero raffreddata (18 ° C) Amquel trattati con acqua. Monitorare il suo recupero dall'anestesia come sopra. Lei dovrebbe iniziare le uova normalmente dopo l'operazione.
6. Ottenere testicoli da una rana maschio con le normali procedure. Conservare i testicoli nella OCM o L15 fino al momento dell'uso. Noi preferiamo testicolo fresco quando la concimazione esperimenti di trasferimento.

6. Recupero degli ovociti e la fecondazione in vitro

1. Ciglia peritoneale guiderà le uova trasferiti (e normale uova celomatica dell'ospite) per le aperture dei ovidotti nella parte anteriore della cavità del corpo. Uova colorate possono essere recuperati all'inizio 2-3 ore dopo il trasferimento dalla spremitura normale. Le uova possono essere ottenuti ogni mezz'ora o giù di lì fino a quando la donna smette di posa.
2. Fertilizzare in una spesospensione rm (in ~ 4 mL 1x MMR) per 4 minuti. Flood e risciacquare a lungo con MMR 0.1x. Le uova dovrebbero attivare normalmente e inizierà a fendere ~ 1,5-2 ore dopo la fecondazione. Uova trasferiti spesso unirà poco più tardi le uova di accoglienza.
3. Rimuovere le mani gelatina con cisteina come embrioni normali e ordinare in piatti separati. Questo può essere fatto in qualsiasi momento, a seconda delle esigenze dell'esperimento. E di solito più facile identificare i vari colori intorno al 4-celle palco e più difficili durante le fasi finali blastula. Cultura le uova a bassa densità (<50 per piatto medio) in pulito MMR 0.1x. Da questo punto, gli embrioni possono essere trattati e manipolati normalmente.
4. Ritorna le rane alla struttura animale e monitor per le complicazioni nei prossimi giorni.
5. Fecondazione metodo alternativo; deposizione delle uova nel buffer di sale
   1. Dopo la rana si è ripreso dall'anestesia, il suo posto in ~ 1L alto sale MMR (1,2 x). Lasciare che la femmina a deporre le uova nel buffer per circa 4-6 ore. Spremere le uova restanti, scolarli MMR 1.2x e ordinare uova colorate nel piatto pulito; rimuovere tutto il liquido possibile.
   2. Lavare a lungo con MMR 0.3x e fertilizzare in volume minimo di 0.3x MMR / sperma sospensione fino attivare uova (10 minuti). Flood con MMR 0.1x e la cultura come sopra. Questa opzione è utile se le uova sono necessarie molte nella stessa fase o se la spremitura manuale di uova danni degli ovociti donatore.

Discussion

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale> 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L'impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni gruppo dovrebbe essere trasferita per garantire che almeno alcuni lo fanno attraverso la gastrulazione. I coloranti vitali generalmente non influenzano gli embrioni sotto le concentrazioni e le condizioni qui descritte, anche se coloranti possono avere effetti negativi in ​​determinate situazioni. Classicamente, rosso neutro è stato segnalato per avere proprietà fototossiche se esposto a forti sorgenti luminose a base di tungsteno. Più di recente, Mir e Heasman (2008) hanno riferito che Bismarck Brown può avere alcuni effetti tossici, se gli embrioni sono incubati a basse temperature. Precauzioni di base quali non eccessivamente morte degli ovociti ed evitare temperature estreme e di illuminazione deve eliminare la possibilità di effetti collaterali colorante vitale.

Il più grande determinanti nel successo o il fallimento del metodo sono la qualità degli ovociti donatore e la femmina di accoglienza. Non esiste un metodo infallibile per determinare se un lotto particolare di ovociti si fecondano bene. Ovario con un'alta percentuale di ovociti atresico dovrebbe essere evitato. Inoltre, abbiamo avuto scarso successo con ovaio che è fortemente vascolarizzato, che potrebbe indicare che il riassorbimento si sta verificando. Ovociti devono essere tenuti a ° C il più possibile i 18 ei altrimenti tenuti in condizioni di buona salute, come gli ovociti non si fecondano se infetti o danneggiati. Appare anche, nel nostro laboratorio, che risultati migliori si ottengono quando il defolliculator è più esperto e in grado di isolare e iniettare un gran numero di ovociti in un breve lasso di tempo. Allo stesso modo, occorre prestare attenzione a selezionare gli host con le uova sano, anche se non è certo che una rana data farà un buon padrone di casa. Come per defolliculating, l'abilità del chirurgo incide anche sul successo della procedura. Ridurre al minimo la lunghezza del tempo è anesthesized l'host sembra fondamentale per un efficace recupero e la fecondazione.

La tempistica complessiva delle varie procedure è fondamentale per la riuscita del trasferimento degli ovociti esperimenti. In generale, più breve è il tempo gli ovociti vengono mantenuti in coltura, la migliore è la fecondazione generale e la salute degli embrioni sarà. Per gli esperimenti knockdown mRNA usando oligonucleotidi antisenso, gli ovociti devono essere colto almeno 24 ore dopo l'iniezione oligo per consentire la riduzione massima del mRNA bersaglio e il fatturato del oligo. Così ovociti devono essere defolliculated il più presto possibile e iniettato nello stesso giorno. Un tipico esperimento potrebbe iniziare il Lunedi con l'isolamento degli ovociti e iniezione, seguita da maturazione e la stimolazione delle femmine il Martedì sera, e trasferimento Mercoledì mattina. Se il fatturato obiettivo RNA è lenta o non vi è abbondante proteina materna, il periodo di coltura può essere esteso a 48 o addirittura 72 ore. Abbiamo il miglior successo quando gli ovociti vengono trasferiti entro 12 ore dal trattamento con progesterone. Troppo maturi ovociti iniziano a deteriorarsi e, in generale fertilizzare male. In genere aggiungere progesterone e iniettare le femmine con hCG circa 12 ore prima di eseguire il trasferimento, sia con gli ovociti e rane mantenuto a ~ 18 ° C durante la notte.

Anche se l'host di trasferimento metodo è laborioso inizialmente, le competenze di base necessarie possono essere acquisite senza troppe difficoltà. L'uso più comune di questo metodo è quello di fecondare ovociti che erano esauriti di specifici mRNA materno mediante iniezione oligonucleotidi antisenso. Altre manipolazioni come sovraespressione di mRNA o trattamento farmacologico può essere eseguita anche. Questi spesso possono avere risultati diversi rispetto a fecondazione dopo l'iniezione, a causa di aumentata espressione o la funzione differenziale nelle uova contro embrioni. E-caderina sovraespressione (. Heasman et al, 1991) e l'irradiazione ultravioletta (Holwill et al, 1987;. Elinson e Pasceri, 1989) sono due esempi interessanti. I risultati preliminari del nostro laboratorio suggeriscono che i metodi di transgenesi utilizzando dell'integrasi iniettati o meganucleases possono lavorare in modo più efficiente in ovociti pure.

La tecnica di trasferimento di host consente la sperimentazione in entrambe le fasi pre e post-fertilizzazione, e quindi in grado di fornire intuizioni non possibile in altri organismi o addirittura, cercando unicamente a livello post-fertilizzazione eventi in Xenopus. Data l'importanza della materna vie di segnalazione nello sviluppo e nella difficoltà e costi di generare mutazioni effetto materno nei vertebrati, questo metodo è destinato a rimanere uno strumento utile per l'indagine di sviluppo iniziale.

7. Rappresentante Resultati

Figura 1. Esempi di buone (in alto) e male (in basso), pinze per defolliculating.

Figura 2. Trasferimento di ovociti in coltura in una femmina di accoglienza. (A) una piccola incisione è fatta nel basso addome della rana ospitante. Lo strato muscolare è un po 'elevato per consentire l'introduzione degli ovociti. (B) gli ovociti sono di vitale importanza tinti e collocato nella cavità del corpo attraverso l'incisione. (C) il completamento della sutura iniziale nello strato muscolare.

Figura 3. Esempi di divisione, gli ovociti trasferiti a 8-16 cellule stadio, dopo la rimozione di strati di gelatina.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and recipes:
OCM (Oocyte culture medium; modified from Wylie et al., 1996)
70% Leibovitz’s L-15 medium (containing l-glutamine)	Invitrogen	11415-064
0.4 mg/ml Bovine serum albumin (BSA; fraction V)	Sigma-Aldrich	A-9418-50g
1x Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P-0781
Adjust to pH 7.6-7.8 with 5N NaOH
Make fresh weekly, store at 18°C.
10X MMR (Marc’s Modified Ringer’s Solution; Zuck et al., 1998)
1M NaCl
20 mM KCl
20 mM CaCl2
10 mM MgCl2
150 mM HEPES
adjust to pH 7.6-7.8
Store at 4°C
Anesthetic solution
1 g/L 3-Aminobenzoic Acid Ethyl Ester (MS222)	Sigma-Aldrich	A-5040
0.7 g/L sodium bicarbonate
Dissolve in Amquel-treated water
Make fresh weekly
Progesterone stocks
10 mM Progesterone (Sigma P- 0130) in 100% Ethanol
Dilute to 1 mM in 100% EtOH for a 500x stock/working solution
Store at -20°C
Vital dyes (modified from Heasman et al., 1991)
Blue: 0.1% Nile Blue A	Aldrich	121479-5G
Red: 0.25% Neutral Red	Sigma-Aldrich	N-6634
Brown: 1% Bismarck Brown	Sigma-Aldrich	B-2759
Green (80 μl blue + 80 μl brown),
Mauve (80 μl blue + 80 μl red).
A sixth color, Orange (80 μl red+ 80 μl brown), can also be used but is often hard to distinguish from brown.
Stocks of Blue, Red and Brown are made up in deionized water in 50 ml tubes, incubated for 20 minutes with rocking and spun in a clinical centrifuge. The supernatants are aliquotted into microfuge tubes and stored at -20°C.