Summary
Neste vídeo, descrevemos um procedimento para a expressão de efetores tipo bacteriana III em levedura ea identificação de fenótipos efetoras induzida por inibição do crescimento. Esses fenótipos podem ser posteriormente explorada para elucidar funções efetoras e metas.
Abstract
Muitas bactérias Gram-negativas patogénicas usam um sistema de secreção do tipo III para translocar um conjunto de proteínas efetoras para o citosol das células do hospedeiro. Dentro da célula, effectors tipo III subverter processos de celular do hospedeiro para suprimir a resposta imunológica e promover o crescimento de patógenos. Efetores tipo numerosos III de plantas e animais patógenos bacterianos foram identificados até o momento, mas apenas alguns deles estão bem caracterizadas. Compreender as funções destes efetores tem sido prejudicada por uma combinação de redundância funcional no repertório efetoras de uma cepa bacteriana dadas, os efeitos sutis que podem exercer para aumentar a virulência, os papéis que são, possivelmente, específicos para estágios determinada infecção, e dificuldades no geneticamente manipulação de certos patógenos. Expressão de efetores tipo III na levedura de brotamento
Protocol
I. Projetar um sistema de expressão de levedura para Effectors Tipo III
Calibrar um sistema de levedura apropriadas para a expressão do tipo III efetoras (s) de interesse é uma tarefa importante e pode exigir algumas tentativas e erros. Fatores de maior relevância que devem ser considerados e otimizados ao projetar um sistema desse tipo são: 1) o promotor de condução expressão do efetor (s), 2) o número de cópias do gene efetor, 3) a tag epítopo usado para verificar a expressão da proteína e 4) a cepa de levedura.
1 Promotora)
Porque effectors tipo bacteriana III pode ser tóxico para células de levedura, um promotor induzível deve ser usado para controlar sua expressão. O promotor GAL1 é comumente utilizado para este fim e sua atividade é regulada pela fonte de carbono presente no meio de crescimento: é reprimido por glicose e induzida por galactose. No entanto, este promotor foi relatado como um pouco de fuga em condições repressão, resultando em toxicidade indesejada. Se um problema semelhante é encontrado, é aconselhável para minimizar o número de cópias do gene efetor como descrito abaixo, ou para usar promotores induzíveis alternativos, como o MET3 ou CUP1 promotores 1. Aqui nós descrevemos os procedimentos para expressar proteínas efetoras de um promotor induzível galactose.
2) Gene no número de cópias
Um parâmetro adicional que afetam o nível de expressão da proteína é o número de cópias do gene efetoras presentes na célula. Níveis de expressão de alta são alcançadas quando o gene efetor é carregado por um. Dois micro-plasmídeo (40-60 cópias por célula) Expressão intermediária é obtida através de um centrômero contendo plasmídeo (03/01 cópias por célula), enquanto a baixa expressão é alcançado quando o gene efetor é integrado no genoma da levedura por recombinação homóloga. Através da combinação de um vetor contendo centrômero eo promotor GAL1 temos expressa com sucesso cerca de 50 efetores da planta patógenos Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria e Pseudomonas syringae pv. Tomate em níveis detectáveis pela análise de immunoblot e com fuga desprezível em condições reprimindo (Salomon e Sessa , não publicado).
3) tag Epitope
Se os anticorpos contra o efetor de interesse não estão disponíveis, uma tag epitopo é fundida com a proteína efetora para monitorar a sua expressão por immunoblot. Tags comumente utilizados são Myc, a hemaglutinina (HA) ou da bandeira, ao qual confiável anticorpos comerciais estão disponíveis. Sugerimos o uso de apenas uma cópia do tag para minimizar indesejados efeitos deletérios sobre a estrutura e atividade da proteína efetora.
4) cepa de levedura
Um requisito fundamental para a cepa de levedura a ser utilizada para expressão é auxotrophy ao marcador selecionável do vetor de expressão. É importante notar que diferentes cepas de leveduras pode apresentar diferentes sensibilidades à expressão de certos efetores. Por exemplo, observamos que a BY4741 e W303 cepas têm sensibilidades diferentes a diversos Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria efetores (Salomon e Sessa, inédito). Portanto, é preferível para testar o efetor (s) de interesse em diferentes cepas de leveduras.
II. Preparação de meios Yeast
Para o crescimento de cepas de levedura que não contém qualquer vector, use YPD (10 g de extrato de levedura / L, 20 g / L de peptona e 2% [w / v] glucose) como meio de crescimento. Para meios sólidos, adicionar 2% [w / v] agar para a solução (se o meio sólido é muito macia, adicione 0,05% [v / v] a partir de uma solução estoque 5 N NaOH ao meio antes da autoclavagem). Recomendamos preparar o meio sem glicose em 90% do volume final e autoclavagem-lo. Pouco antes do uso, encher o volume a 100% com um filtro esterilizadas 20% de solução de glicose [w / v] (manter a solução de glicose a 20% a 4 ° C para evitar a contaminação).
Para o crescimento de cepas de levedura contendo um vetor que fornece prototrophy a um marcador selecionável (leucina, histidina uracil, ou triptofano), uso médio de abandono sintética sem leucina, histidina uracil e triptofano (6,7 g / L base nitrogenada de levedura sem aminoácidos , 1,4 g de levedura / L sintéticos drop-out suplemento médio) e contendo 2% [w / v] glicose, ou 2% [w / v] galactose e 1% [w / v] rafinose. Para meios sólidos, adicionar 2% [w / v] agar para a solução. Recomendamos preparar o meio em 90% do volume final e autoclavagem-lo. Pouco antes do uso, encher o volume para 100%, com uma solução de glicose, esterilizada por filtração de 20%, ou uma galactose, esterilizada por filtração de 20% + solução de rafinose 10%, dependendo da fonte de carbono desejado (manter a glicose a 20% e os 20% galactose + soluções rafinose 10% a 4 ° C para evitar a contaminação). Dependendo do marcador selecionável do vec expressãotor, adicione os outros aminoácidos ou uracil antes de usar (10 ml / L de um 1 g/100 ml leucina estoque, 10 ml / L a partir de um estoque uracil 200 mg/100 ml, 2 ml / L de um 1 g/100 ml de caldo de histidina, ou 2 ml / L de um g/100 ml um estoque triptofano). Ao preparar ações leucina e uracila, esterilizá-las em autoclave e manter a temperatura ambiente. Ao preparar ações histidina e triptofano, esterilizá-los através da filtragem, embrulhe a garrafa com folha de alumínio para proteger da luz, e manter a 4 ° C. Nos procedimentos descritos a seguir, média de abandono sintético suplementado com leucina, histidina uracil e triptofano é designado como meio completo sintético.
Solid-media placas podem ser armazenadas por até dois meses a 4 ° C. Antes do uso, secar as placas por 20 min em uma capa de fluxo laminar estéril à temperatura ambiente.
III. Transformação de levedura
- Antes de iniciar o processo de transformação do fermento, preparar as três soluções seguintes: 50% [w / v] polietileno glicol (PEG) 3350 solução, uma solução 1 M pH = 8,0 LiAc, e uma solução de TE (100 mM Tris pH = 6,85 e 10 mM EDTA pH = 8,0). Filtro de esterilizar as soluções e manter a 4 ° C.
- Usando uma haste longa de madeira ou um loop de inoculação estéril, escolher uma colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) de um prato fresco e inocular 3 ml de YPD em um tubo de polipropileno de 15 ml. Brevemente Vortex. Coloque o tubo de cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C com rotação constante.
- De manhã, retire a cultura do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Após a centrifugação, remover completamente o sobrenadante.
- Ressuspender as células em um buffer de ressuspensão ml (10% [v / v] TE solução, 10% [v / v] 1 M solução LiAc) e misturar em vortex.
- Para cada plasmídeo para ser transformada e uma transformação de controle adicionais, transferência de 100 ul da suspensão celular para um microtubo.
- A cada tubo, adicionar 5 mL de um único filamento de DNA de esperma de salmão (10 mg / ml) e 250-500 ng de DNA plasmidial para ser transformado (exceto para o tubo de controle).
- Adicione cuidadosamente a cada 650 mL de solução de tubo de transformação (10% [v / v] TE solução, 10% [v / v] 1 M solução LiAc, 80% [v / v] de 50% [w / v] solução de PEG ) e vortex.
- Incubar a 30 ° C por 30 min em um rolo.
- Remover os tubos do shaker, adicionar 70 mL de DMSO, e misturar por inversão dos tubos 10-15 vezes (não vortex para evitar a quebra das células).
- Colocar os tubos em um banho de 42 ° C a água pré-aquecida e incubar por 15 min.
- Remover os tubos do banho-maria e imediatamente colocá-los no gelo durante 2 min.
- Uma vez que os tubos têm arrefecido, centrifugar para a 800 g por 5 min à temperatura ambiente.
- Pegue os tubos fora do microcentrífuga e remova cuidadosamente o sobrenadante viscoso com uma pipeta.
- Ressuspender o pellet celular de cada tubo em 150 mL de água destilada estéril duplo (DDW), e espalhar a suspensão de células em um prato completo meio sintético contendo 2% de glicose como fonte de carbono e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual fornece o plasmídeo prototrophy.
- Deixar as placas abertas para 2 min e deixe secar em uma capela de fluxo laminar. Coloque as placas em um 30 ° C incubadora de 2-3 dias.
- Colônias uma vez (1-2 mm de diâmetro) têm aparecido nas placas, escolher cerca de 10 colônias única de cada transformação e transferi-los para um prato fresco. Ao transferir as colônias, os patches 2 cm x 2 cm a permitir o crescimento de uma grande quantidade de células de levedura. Incubar as placas em estufa a 30 ° C por dois dias.
- Quando as manchas de fermento ter crescido, retire as placas da incubadora e vedá-las com parafilme. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C. Transferência de colônias de um prato novo a cada 10-14 dias.
IV. Preparando uma proteína de extrato de levedura para verificar Expressão Effector por Immunoblot
- Escolha uma colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) de uma placa nova para um tubo de polipropileno de 15 ml contendo 3 ml do meio sintético apropriado completo suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy. Coloque o tubo de cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C.
- No dia seguinte, retire a cultura do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Remover os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 3 ml de DDW estéril e misturar em vortex.
- Centrifugar novamente, descartar células sobrenadante e ressuspender em 3 ml de DDW estéril.
- Transferir 200 mL da suspensão de células para um tubo de 15 ml, contendo 3 ml de meio completo sintético suplementado com galactose e rafinose 2% 1% como fonte de carbono, e sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy.Misturar em vortex, coloque em um rolo, e incubar durante a 30 ° C.
- Na manhã seguinte, transferir 1 ml da cultura (ou mais para as culturas de baixa densidade) para um microtubo. Colher as células por centrifugação a 800 g por 5 min à temperatura ambiente.
- Daqui em diante, o trabalho em um exaustor para evitar respirar β-mercaptoetanol vapores tóxicos. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta e ressuspender o pellet celular em 100 l de gelado solução de lise (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercaptoetanol). Misture vigorosamente em vortex e incubar no gelo por 30 min.
- Durante a incubação, determinar o volume de HCl (6 N) necessário para titulação 100 l de tampão de lise de pH 9-10. Para este objectivo, colocar 10 microtubos em um rack e transferência de 100 l do tampão de lise em cada um deles. Adicionar vários volumes (1-10 L) de HCl (6 N) a cada tubo e misturar em vortex. Tomar uma amostra e verifique o pH da solução usando um filtro indicador de pH.
- No final da incubação, adicionar o volume de HCl determinado na etapa anterior ao lisado e misturar em vortex (para melhor precisão, coloque a solução de HCl no lado do tubo sem inserir a ponta no lisado).
- Adicionar 50 ul de tampão de amostra de 3x (30% [v / v] glicerol, 15% [v / v] β-mercaptoetanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] sódio dodecil sulfato [SDS] e alguns grãos de azul de bromofenol) ao lisado e misturar em vortex (se a solução fica amarela, isso significa que o pH é muito baixo, e alguns microlitros de solução de lise deve ser adicionado até que a solução fica azul).
- Ferva a solução lisado por 5 min em um bloco de aquecimento após a punção um furo na tampa do microtubo com uma agulha.
- Remova o microtubo do bloco de aquecimento e deixar a solução esfriar por 2 min à temperatura ambiente.
- Vortex a solução lisado e depois girá-lo por 10 seg. Carga de 30 mL para um gel SDS-PAGE para análise immunoblot.
V. Spotting Ensaio para detectar Effector induzida Fenótipos inibição do crescimento
- De uma placa de escolher uma nova colônia de levedura (1-2 mm de diâmetro) com o plasmídeo de expressão de interesse e inocular, em um tubo de polipropileno de 15 ml, 3 ml de meio completo sintético suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono e sem o amino ácido ou de nucleotídeos ao qual a expressão plasmídeo fornece prototrophy. Repita o mesmo procedimento para uma cepa de levedura controle carregando um plasmídeo vazio. Coloque os tubos cultura em um rolo e incubar durante a 30 ° C com rotação constante.
- No dia seguinte, retire as culturas do rolo e centrifugar a 800 g por 5 min à temperatura ambiente. Remover os tubos da centrífuga e desprezar o sobrenadante.
- Ressuspender o pellet celular em 3 ml de DDW estéril e misturar em vortex.
- Repita os passos de centrifugação e as células ressuspender em 3 ml de DDW estéril.
- Para determinar a densidade óptica (DO), a transferência de 100 l de cada cultura para um microtubo contendo 900 mL e DDW vortex. Despeje o conteúdo dos tubos numa cuvete de plástico e medir a absorvância a um comprimento de onda de 600 nm (use como referência uma tina cheia com 1 ml de DDW). Calcular o OD 600 das culturas iniciais multiplicando o OD 600 das culturas na cuvete por um fator de diluição de 10.
- Em seguida, com base na OD 600 das culturas iniciais, preparar suspensões de células (1 ml) com um OD 600 = 1,0 em microtubos estéreis.
- Usando 3 microtubos estéreis preenchidos com 900 mL DDW estéril, prepare três de 10 diluições (OD 600 = 0,1, 0,01 e 0,001) de cada suspensão de células (OD 600 = 1,0), preparada no passo anterior.
- Prepare duas placas contendo meio completo sintético sem o aminoácido ou nucleotídeo para o qual o plasmídeo de escolha fornece prototrophy. O meio de uma placa deve ser suplementada com 2% de glicose e que de outra placa com galactose e rafinose 2% 1%. Seca as placas em uma capa de fluxo laminar estéril, em temperatura ambiente por 20 min e coloque-os sobre uma grade.
- Para cada cultura, 10 mL local a partir dos quatro diluições em uma fila em ambos os reprimir e induzindo mídia.
- Depois de spotting, deixe as placas no capô aberto por vários minutos. Quando as manchas são seca, cobrir as placas e colocá-los em uma incubadora de 30 ° C por 2-3 dias.
- Após a incubação, retire as placas e analisar o crescimento do fermento. Primeiro, confirme que a densidade de células são semelhantes na placa contendo meio de repressão. Então, comparar o crescimento da cultura expressando a proteína efetora de interesse com a cultura que leva um vetor vazio na placa contendo meio de indução.
Nota: effectors pode ter como alvo processos celulares que não são limitante para o crescimento da levedura em condições de crescimento padrão de laboratório.Para permitir a identificação de fenótipos inibição do crescimento de efetores tais, a mídia induzindo podem ser complementados com compostos que alteram as funções celulares de leveduras, aumentando assim a sua sensibilidade aos efetores. Para uma lista de produtos químicos que podem, eventualmente, ser integrados neste procedimento, consulte a Parsons et al. (2004) 2.
VI. Resultados representante
A levedura representante spotting ensaio e detecção de fenótipos inibição de crescimento induzida por expressão de efetores tipo III são mostradas na figura. 1. Neste experimento, o tipo III effectors AvrPto, HopAA1-1 e AvrE1 do fitopatogênicos bactéria Gram-negativa Pseudomonas syringae pv tomate. (Pst) foram expressas a partir do centrómero pGML10 contendo plasmídeo na cepa de levedura BY4741, e testados quanto à capacidade para inibir o crescimento do fermento. Culturas de leveduras individuais expressando effectors Pst tipo III sob o controle do promotor induzível galactose GAL1 ou contendo um vetor vazio em série foram diluídos e semeados em reprimir (glicose) ou induzir (galactose) media (Fig. 1). Em reprimir médio, cepas de leveduras carregando plasmídeos para a expressão de AvrPto e HopAA1-1 apresentaram crescimento semelhante ao da estirpe do controlo contendo um vetor vazio. No entanto no mesmo meio, o fermento carregando AvrE1 exibido um crescimento um pouco menor, provavelmente relacionadas com algum grau de vazamento do promotor GAL1 e para o efeito citotóxico de alto AvrE1. Em condições de indução, expressão da efetoras AvrE1 causou um fenótipo inibição drástica o crescimento refletido pela falta de colônias em qualquer diluição. Como observado anteriormente por Munkvold et al. 3, expressão de HopAA1-1 também resultou em inibição severa do crescimento, enquanto AvrPto não mostraram qualquer efeito.
Figura 1. Inibição de crescimento causados por leveduras expressão do pv syringae Pseudomonas tomate. (Pst) Tipo III effectors AvrE1 e HopAA1-1. Cepas de levedura (BY4741) contendo o plasmídeo pGML10, vazios ou carregando GAL1-driven cassetes para galactose induzível-expressão de AvrPto , HopAA1-1 ou AvrE1, foram cultivadas durante a noite em meio completo sintético suplementado com glicose (2%) como fonte de carbono, e sem leucina. Culturas foram lavadas, normalizada para OD 600 = 1.0 e de série de 10 diluições foram vistos em sintético completa falta de meios sólidos contendo leucina e glicose (2%) ou galactose (2%) e rafinose (1%). Fotografias foram tiradas depois de 2 e 3 dias de crescimento a 30 ° C para a levedura crescendo em glicose e galactose mídia, respectivamente.
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Discussion
Nesta apresentação, ilustramos como usar o brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae como um sistema heterólogo para a expressão do tipo III bacteriana proteínas efetoras e como identificar efetoras induzida fenótipos inibição do crescimento. Importante, esses fenótipos podem ser utilizados em telas genéticos para identificar os supressores do impacto negativo sobre o crescimento de efetores levedura. Supressores pode representar tanto alvos diretos da efetoras estudadas ou proteínas que participam de processos celulares afetados pela ação. Efetores tipo III de numerosos animais e vegetais patógenos bacterianos foram expressas em levedura até à data, e fenótipos inibição de crescimento causados por vários deles foram utilizados para identificar processos ou caminhos que eles 1,4 alvo. Em vários estudos, toxicidade efetoras em levedura também foi explorada com sucesso para identificar novas effectors bacteriana 5. Além disso, effector induzida por inibição do crescimento fenótipos podem ser exploradas para a descoberta de drogas em telas de bibliotecas de compostos químicos que inibem a toxicidade de efetores na levedura 6.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Ciência Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212750 | |
| Peptone | Difco Laboratories | 211677 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco Laboratories | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | >99%; <0.1% glucose |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | R0250 | >98% |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| L-histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | Desiccate |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4958 | |
| Tris (base) | JT Baker | 4109-02 | |
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B6131 | |
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck & Co., Inc. | 8.22050.1000 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt Ltd | 67.742 | |
| Inoculation loop | Sigma-Aldrich | Z643009 | Sterile |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck & Co., Inc. | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
