Summary
I denna video beskriver vi ett förfarande för uttrycket av bakteriell typ III effektenheter i jäst och identifieringen av effektor-inducerad fenotyper tillväxthämning. Sådana fenotyper kan sedan utnyttjas för att belysa effektorfunktioner och mål.
Abstract
Många gramnegativa sjukdomsframkallande bakterier använder en typ III sekretion system till translocate en svit av effektor proteiner i cytosolen av värdceller. I cellen, typ III effectors undergräva värd cellulära processer för att undertrycka immunsvaret och främja patogen tillväxt. Många typ III effektenheter av vegetabiliska och animaliska bakterier har identifierats hittills, men bara ett fåtal av dem är väl karakteriserade. Förstå funktioner dessa effektenheter har underminerats av en kombination av funktionell redundans i effektor repertoar av en viss bakteriestam, de subtila effekter som de kan utöva för att öka virulens, roller som eventuellt specifika för vissa infektioner faser, och svårigheter att genetiskt manipulera vissa patogener. Redovisning av typ III effektenheter i spirande jäst
Protocol
I. utforma ett system Jäst Uttryck för typ III Effektenheter
Kalibrera en jäst-system lämplig för uttryck av typ III effektor (er) av intresse är en viktig uppgift och kan kräva några försök och misstag. Faktorer som har stor relevans som bör beaktas och optimeras när man utformar ett sådant system är: 1) promotorn drivande uttryck för effektor (s), 2) Antal kopior av den effektor genen, 3) epitop taggen används för att verifiera proteinuttryck och 4) jästen stammen.
1) Arrangören
Eftersom bakteriell typ III effektenheter kan vara giftiga för jästceller, bör en inducerbara promotor användas för att kontrollera sina uttryck. Den GAL1 promotor används ofta för detta ändamål och dess verksamhet regleras av kolkälla som finns i odlingsmedium: det är förtryckta av glukos och framkallas av galaktos. Detta var dock promotor rapporterades som något läcker i förtränga tillstånd som leder till oönskade effekter. Om ett liknande problem påträffas, är det lämpligt att minimera Antal kopior av den effektor genen som beskrivs nedan, eller att använda alternativa inducible initiativtagare, till exempel MET3 eller CUP1 initiativtagare 1. Här beskriver vi rutiner för att uttrycka effektor proteiner från en galaktos-inducible promotor.
2) genkopior-nummer
En ytterligare parameter som påverkar nivån av protein uttryck är antalet kopior av effektor genen finns i cellen. Höga uttryck nivå uppnås när effektor genen bärs av en 2-micron plasmid (40-60 kopior per cell). Intermediate uttryck erhållits med hjälp av en centromer innehåller plasmid (1-3 kopior per cell), medan låg uttrycket uppnås när effektor genen är integrerad i jästgenomet av homolog rekombination. Genom att kombinera en centromer som innehåller vektorn och GAL1 initiativtagaren Vi har framgångsrikt uttryckts över 50 effektenheter av växtpatogener Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria och Pseudomonas syringae pv. Tomat på nivåer upptäckas med immunoblot analys och med försumbar läckage under förtränga förhållanden (Salomon och Sessa , opublicerad).
3) epitop tagg
Om antikroppar mot effektor av intresse inte finns, är en epitop tagg smält till effektor protein för att följa sitt uttryck genom immunoblot. Vanligt använda taggar Myc, hemagglutinin (HA) eller flagga, som tillförlitliga kommersiella antikroppar är tillgängliga. Vi föreslår att du använder bara en kopia av taggen för att minimera oönskade skadliga effekter på struktur och verksamhet i effektor protein.
4) jäst stam
Ett grundläggande krav för jästen stam som ska användas för uttryck är auxotrophy till markör av uttrycket vektor. Det är viktigt att notera att olika jäststammar kan visa olika känslighet på uttryck av vissa servon. Till exempel noterade vi att BY4741 och W303 stammar har olika känslighet för olika Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria effektenheter (Salomon och Sessa, opublicerad). Därför är det bättre att testa effektor (er) av intresse i olika jäststammar.
II. Beredning av jäst Media
För tillväxt av jäststammar som inte innehåller någon vektor, använd YPD (10 g / L jästextrakt, 20 g / L pepton och 2% [w / v] glukos) som tillväxten medium. För fasta medier, tillsätt 2% [w / v] agar till lösningen (om det fasta mediet är mycket mjuk, tillsätt 0,05% [v / v] från en 5 N NaOH stamlösning till mediet innan autoklavering). Vi rekommenderar att förbereda medium utan glukos i 90% av den slutliga volymen och autoklavering det. Strax före användning, fyll volymen till 100% med ett filter-steriliserade 20% [w / v] glukoslösning (behålla 20% glukoslösning vid 4 ° C för att förhindra kontaminering).
För tillväxt av jäststammar som innehåller en vektor som ger prototrophy till en markör (leucin, uracil, histidin och tryptofan), använda syntetiska avhopp medium utan leucin, uracil, histidin och tryptofan (6,7 g / L jäst kväve bas utan aminosyror , 1,4 g / L jäst syntetiska avhopp medelstora tillägg) och som innehåller 2% [w / v] glukos, eller 2% [w / v] galaktos och 1% [w / v] raffinos. För fasta medier, tillsätt 2% [w / v] agar till lösningen. Vi rekommenderar att förbereda medium i 90% av den slutliga volymen och autoklavering det. Strax före användning, fyll volymen till 100% med ett filter-steriliserade 20% glukoslösning, eller ett filter-steriliserade 20% galaktos + 10% raffinos lösning, beroende på önskad kolkälla (behålla 20% glukos och 20% galaktos + 10% raffinos lösningar vid 4 ° C för att förhindra kontaminering). Beroende på markör av uttrycket VECTor, lägg den andra aminosyror eller uracil före användning (10 ml / L från en 1 g per 100 ml leucin lager, 10 ml / L från en 200 mg/100 ml uracil lager, 2 ml / l från en 1 g per 100 ml histidin lager, eller 2 ml / l från en 1 g per 100 ml tryptofan lager). När man förbereder leucin och uracil lager, sterilisera dem genom autoklavering och förvara i rumstemperatur. När man förbereder histidin och tryptofan lager, sterilisera dem genom att filtrera, linda flaskan med aluminiumfolie för att skydda mot ljus, och hålla vid 4 ° C. I förfaranden som beskrivs nedan, syntetiska hoppar mediet kompletteras med leucin, är uracil, histidin och tryptofan betecknas som syntetiska komplett medium.
Solid-media plattor kan lagras i upp till två månader vid 4 ° C. Före användning, torra plattorna under 20 min i en steril laminärt flöde huva vid rumstemperatur.
III. Jäst Transformation
- Innan du börjar proceduren jästen omvandling, förbereda följande tre lösningar: en 50% [w / v] polyetylenglykol (PEG) 3350-lösning, en 1 M LiAc pH = 8,0, och en TE-lösning (100 mM Tris pH = 6,85 och 10 mM EDTA pH = 8,0). Filter-sterilisera lösningar och hålla vid 4 ° C.
- Med hjälp av en lång trä axel eller en steril ympning slinga, plocka en jäst koloni (1-2 mm i diameter) från en färsk platta och inokulera 3 ml YPD i ett 15 ml polypropylen rör. Vortex kort. Placera kulturen röret i rulle och inkubera över natten vid 30 ° C med konstant rotation.
- På morgonen, ta bort kulturen från rullen och centrifugera vid 800 gi 5 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugering, helt ta bort supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 1 ml resuspension buffert (10% [v / v] TE-lösning, 10% [v / v] 1 M LiAc lösning) och blanda genom att vortexa.
- För varje plasmid att förvandlas och en ytterligare kontroll omvandling, överföring 100 ìl av cellsuspension till ett mikrorör.
- Till varje rör, tillsätt 5 ìl av sträng lax spermie-DNA (10 mg / ml) och 250-500 ng plasmid-DNA att omvandlas (utom för kontroll röret).
- Tillsätt försiktigt till varje rör 650 ìl av omvandling-lösning (10% [v / v] TE-lösning, 10% [v / v] 1 M LiAc lösning, 80% [v / v] 50% [w / v] PEG-lösning ) och skaka.
- Inkubera vid 30 ° C i 30 min på en rulle.
- Ta bort rören från shakern, tillsätt 70 ìl av DMSO, och blanda genom att vända rören 10-15 gånger (inte vortex för att undvika att bryta celler).
- Placera rören i en 42 ° C förvärms vattenbad och inkubera i 15 min.
- Ta bort rören från vattenbadet och omedelbart placera dem på is i 2 min.
- När rören har svalnat, centrifugera dem vid 800 gi 5 minuter vid rumstemperatur.
- Ta rören ur mikrocentrifug och försiktigt avlägsna trögflytande supernatanten med hjälp av en pipett.
- Resuspendera cellpelleten i varje rör i 150 l sterilt dubbla destillerat vatten (DDW), och sprida cellsuspension på ett syntetiskt komplett medelstora skylt som innehåller 2% glukos som kolkälla och utan aminosyror eller nukleotid som plasmiden ger prototrophy.
- Låt plattorna öppen i 2 minuter och låt dem torka i ett laminärt flöde huva. Placera plattorna i en 30 ° C inkubator för två-tre dagar.
- När kolonier (1-2 mm) har dykt upp på tallrikar, plocka cirka 10 enstaka kolonier från varje omvandling och överföra dem till en ny platta. Vid överlåtelse kolonierna, gör 2 cm x 2 cm plåster för att möjliggöra tillväxt av en stor mängd jästceller. Inkubera plattorna i en inkubator vid 30 ° C i två dagar.
- När jästen fläckar har vuxit, ta bort plattorna från kuvösen och täta dem med parafilm. Plattorna kan förvaras vid 4 ° C. Överför kolonier till en ny platta var 10-14 dagar.
IV. Förbereda ett Jäst Protein Extract to Verify Effektenheter uttryck genom Immunoblot
- Välj en jäst koloni (1-2 mm i diameter) från en ny platta till en 15 ml polypropylen rör som innehåller 3 ml av lämpliga syntetiska hela mediet kompletteras med 2% glukos som kolkälla och utan aminosyror eller nukleotid som plasmiden val ger prototrophy. Placera kulturen röret i rulle och inkubera över natten vid 30 ° C.
- I den följande dagen, ta bort kulturen från rullen och centrifugera vid 800 gi 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort rören från centrifugen och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 3 ml sterilt DDW och blanda genom att vortexa.
- Centrifugera igen, kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml steril DDW.
- Överför 200 l av cellsuspensionen till ett nytt 15 ml rör som innehåller 3 ml syntetiskt komplett mediet kompletteras med 2% galaktos och 1% raffinos som kolkälla och utan aminosyran eller nukleotid som plasmiden val ger prototrophy.Blanda genom att vortexa, plats i en rulle, och inkubera över natten vid 30 ° C.
- I den följande morgonen, överför 1 ml av kulturen (eller mer för låg densitet kulturer) till ett mikrorör. Harvest cellerna genom centrifugering vid 800 gi 5 minuter vid rumstemperatur.
- Från och med nu, arbeta i dragskåp för att undvika inandning av β-merkaptoetanol giftiga ångor. Ta försiktigt bort supernatanten med hjälp av en pipett och resuspendera cellpelleten i 100 ìl iskall lys-lösning (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-merkaptoetanol). Blanda kraftigt genom att vortexa och inkubera på is i 30 min.
- Under inkubation, fastställa omfattningen av HCl (6 N) krävs för titering 100 ìl lyseringsbuffert till pH 9-10. I detta syfte placera 10 mikrorör i ett rack och överföra 100 ìl av lyseringsbuffert i varje av dem. Lägg till olika volymer (1-10 l) av HCl (6 N) till varje rör och blanda genom att vortexa. Ta ett prov och kontrollera pH-värdet i lösningen med en remsa pH-indikator.
- I slutet av inkubationen, tillsätt HCl volym som beräknats i föregående steg till lysat och blanda genom att vortexa (för bättre precision, placera HCl-lösning på sidan av röret utan att sätta spetsen i lysat).
- Tillsätt 50 ìl 3x prov buffert (30% [v / v] glycerol, 15% [v / v] β-merkaptoetanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [w / v ] natriumdodecylsulfat [SDS] och några korn Bromfenolblått) till lysat och blanda genom att vortexa (om lösningen blir gul betyder det att pH-värdet är för lågt, och ett par mikroliter av lys lösningen ska läggas tills lösningen blir blå).
- Koka lysat lösningen för 5 min på ett värmeblock efter punktering ett hål i locket till mikrorör med en nål.
- Ta bort mikrorör från värmeblocket och låt lösningen svalna i 2 minuter i rumstemperatur.
- Vortexa lysat lösning och sedan snurra den ner i 10 sek. Ladda 30 l på en SDS-PAGE gel för immunoblot analys.
V. Spotting-analys för att upptäcka Effektenheter-inducerad fenotyper tillväxthämning
- Från en färsk platta välja en jästsvamp koloni (1-2 mm diameter) bär uttrycket plasmiden av intresse och inokulera, i ett 15 ml polypropylen rör, 3 ml syntetiskt komplett mediet kompletteras med 2% glukos som kolkälla och utan aminosyran syra eller nukleotid vilken uttrycket plasmiden ger prototrophy. Upprepa samma procedur för en kontroll jäst stam bär en tom plasmid. Sätt kulturen rören i en berg-och inkubera över natten vid 30 ° C med konstant rotation.
- I den följande dagen, ta bort kulturer från rullen och centrifugera vid 800 gi 5 minuter vid rumstemperatur. Ta bort rören från centrifugen och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 3 ml sterilt DDW och blanda genom att vortexa.
- Upprepa centrifugeringen steget och resuspendera cellerna i 3 ml steril DDW.
- Att fastställa deras optiska densitet (OD), överföring 100 l av varje kultur till ett mikrorör med 900 l DDW och skaka. Häll innehållet i rören i en plast kyvetten och mät absorbansen vid våglängden 600 nm (använder som referens en kyvett fylld med 1 ml DDW). Beräkna OD 600 av den ursprungliga kulturer genom att multiplicera OD 600 av kulturer i kyvetten med en utspädning faktor 10.
- Nästa, baserat på OD 600 av de ursprungliga kulturer, förbereda cellsuspensioner (1 ml) med en OD 600 = 1,0 i sterila mikrorör.
- Genom att använda 3 sterila mikrorör fyllt med 900 l steril DDW, förbereda tre 10-faldig seriespädningar (OD 600 = 0,1, 0,01 och 0,001) från varje cellsuspension (OD 600 = 1,0) som utarbetats i föregående steg.
- Förbered två plåtar som innehåller syntetiska komplett medium utan aminosyran eller nukleotid som plasmiden val ger prototrophy. Mediet av en tallrik bör kompletteras med 2% glukos och den andra plattan med 2% galaktos och 1% raffinos. Torka plattorna i en steril laminärt flöde huva i rumstemperatur i 20 minuter och lägg dem på ett rutnät.
- För varje kultur, plats 10 l från de fyra spädningar i rad på både förtrycka och förmå media.
- Efter spotting, lämna plattorna öppnar i huven i flera minuter. När fläckarna är torra, täck plattorna och lägg dem i en 30 ° C inkubator för 2-3 dagar.
- Efter inkubation, ta ut plåtarna och analysera jäst tillväxt. Först bekräfta att cellen densiteter är liknande på plattan innehåller förtrycker medium. Sedan jämföra tillväxten av kulturen som uttrycker effektor proteinet av intresse med kulturen bär en tom vektor på tallriken innehåller förmå medium.
Obs: effektenheter kan rikta cellulära processer som inte är hastighetsbestämmande till jäst tillväxt under normala förhållanden laboratorium tillväxt.För att kunna identifiera fenotyper tillväxthämning för sådana effektenheter kan förmå media kompletteras med läkemedel som förändrar jäst cellulära funktioner, vilket ökar deras känslighet för effectors. En lista över kemikalier som eventuellt kan integreras i detta förfarande, se Parsons et al. (2004) 2.
VI. Representativa resultat
En representant jäst spotting analys och detektion av fenotyper tillväxthämning orsakad av uttryck av typ III effektenheter visas i figur. 1. I detta experiment var typ III effectors AvrPto, HopAA1-1 och AvrE1 av gramnegativa fytotoxiska bakterien Pseudomonas syringae pv. Tomat (PST) uttryckt från centromer-innehållande plasmid pGML10 i jästen stammen BY4741 och testats för sin förmåga att hämma jäst tillväxt. Individuella jästkulturer uttrycka Pst typ III effektenheter under kontroll av galaktos inducerbara GAL1 promotor eller innehåller en tom vektor var seriellt utspädda och pläterade på förtränga (glukos) eller inducera (galaktos) media (bild 1). På undertrycka medium, utställda jäststammar bär plasmider för uttryck av AvrPto och HopAA1-1 liknande tillväxt kontroll stam som innehåller en tom vektor. Men på samma medium, jäst bär AvrE1 visade en något lägre tillväxt, förmodligen relaterade till en viss grad av läckage av GAL1 initiativtagaren och den höga cytotoxiska effekten av AvrE1. I förmå förhållanden orsakade uttryck för AvrE1 effektor en drastisk fenotyp tillväxthämning speglas av bristen på kolonier i någon utspädning. Som tidigare observerats av Munkvold et al. 3, uttryck för HopAA1-1 också resulterat i allvarlig hämning av tillväxten, medan AvrPto inte visar någon effekt.
Figur 1. Jäst tillväxthämning orsakad av uttryck av Pseudomonas syringae pv. Tomat (PST) typ III effektenheter AvrE1 och HopAA1-1. Jäststammar (BY4741) som innehåller plasmiden pGML10, antingen tom eller transporterar GAL1 driven kassetter för galaktos-inducerbara uttryck för AvrPto , HopAA1-1 eller AvrE1, odlades över natten i syntet komplett mediet kompletteras med glukos (2%) som kolkälla, och saknar leucin. Kulturer har tvättats rena, normaliserad till OD 600 = 1,0 och serienummer 10-faldigt utspädningar sågs på syntetiska kompletta fasta medier saknas leucin och innehåller glukos (2%), eller galaktos (2%) och raffinos (1%). Fotografier togs efter 2 och 3 dagar av tillväxt vid 30 ° C för jäst växer i glukos och media galaktos, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna presentation illustrerade vi hur du använder spirande jästsvampen Saccharomyces cerevisiae som en heterolog system för uttrycket av typ III bakteriella effektor proteiner och hur man identifierar effektor-inducerad fenotyper tillväxthämning. Viktigt kan dessa fenotyper utnyttjas i genetisk skärmar för att identifiera dämpning av de negativa effekterna av effektenheter på jäst tillväxt. Dämpning kan representera antingen direkt mål av effektor studerat eller proteiner som deltar i cellulära processer påverkas av effektor. Många typ III effektenheter från växt-och bakteriella patogener har kommit till uttryck i jäst hittills och tillväxthämning fenotyper orsakas av flera av dem används för att identifiera processer eller vägar som de riktar 1,4. I flera studier har effektor toxicitet i jäst också framgångsrikt utnyttjas för att identifiera nya bakteriell effectors 5. Dessutom kan effektor-inducerad tillväxthämning fenotyper utnyttjas för läkemedelsutveckling i skärmar av kemiska bibliotek för föreningar som hämmar toxicitet effektenheter i jäst 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Israel Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212750 | |
| Peptone | Difco Laboratories | 211677 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco Laboratories | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | >99%; <0.1% glucose |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | R0250 | >98% |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| L-histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | Desiccate |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4958 | |
| Tris (base) | JT Baker | 4109-02 | |
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B6131 | |
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck & Co., Inc. | 8.22050.1000 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt Ltd | 67.742 | |
| Inoculation loop | Sigma-Aldrich | Z643009 | Sterile |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck & Co., Inc. | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
