Summary
在这个视频中，我们描述酵母效应引起的生长抑制表型鉴定的细菌Ⅲ型效应的表达程序。这种表型，随后可利用澄清效应功能和目标。
Abstract
许多革兰氏阴性致病菌使用III型分泌系统转运到宿主细胞的细胞质效应蛋白套件。在细胞内，III型效应颠覆宿主细胞的过程，抑制免疫反应，促进病原体的生长。无数III型效应的植物和动物的细菌病原体已经确定的日期，但其中只有少数是很好的特点。了解这些效应的功能已经削弱了功能冗余的结合，在一个给定的菌株效应剧目，潜移默化的影响，他们可能对增加的毒性，可能是特定于某些感染阶段的角色，并在基因困难操纵某些病原体。 Ⅲ型效应在芽殖酵母中的表达
Protocol
一酵母表达系统的设计III型效应
校准适合III型效应（S）的利益表达的酵母系统的一项重要任务，可能需要一些试验和错误。和优化设计这样一个系统时，应考虑的主要相关因素有：1）启动子驱动表达的效应（S），2）效应基因的副本，3号）的抗原表位的标签，用来验证蛋白的表达和4）的酵母菌株。
1）启动
由于细菌Ⅲ型效应可能对酵母细胞有毒性，应使用诱导启动子控制的表达。 GAL1启动子通常用于此目的，它的活动是在培养基中的碳源的规管：它是被压抑的葡萄糖和半乳糖诱导。但据报道，这个发起人轻微漏水，造成意外的毒性条件下压制。如果遇到类似的问题，最好是尽量减少效应基因的拷贝数如下所述，或使用替代诱导促销员，如MET3或CUP1促销员1 ，。在这里，我们描述为一个半乳糖诱导的启动子表达的效应蛋白的程序。
2）基因拷贝数
蛋白表达水平的影响是一个额外的参数效应基因在细胞中的拷贝数。高表达水平的效应基因进行时2微米质粒（每单元40-60份）。中间表达式是通过使用每个细胞含有一个着丝粒质粒（1-3份），而低表达效应基因通过同源重组整合到酵母基因组。 “相结合的着丝粒含载体和GAL1推动者，我们已经成功地表达了约50植物病原黄单胞菌野油菜PV。vesicatoria和假单胞菌丁香光伏效应。免疫印迹分析检测的水平和抑制条件下可以忽略不计漏（所罗门和塞萨的番茄，未发表）。
3）抗原表位标记
如果抗体对效应的利益都无法使用，抗原表位标记是融合的效应蛋白，免疫印迹，以监察其表达。常用的标签Myc基因，血凝素（HA）或标志，可靠的商业抗体。我们建议使用只有一个标签的副本，以最大限度地减少不受欢迎的效应蛋白的结构和活动的有害影响。
4）酵母菌株
一个要表达的酵母菌株的根本要求是营养缺陷型表达载体的选择标记。重要的是要注意不同的酵母菌株，表达一定的效应可能会显示不同的敏感性。例如，我们观察到，BY4741和W303的菌株有几个油菜黄单胞菌PV。vesicatoria效应（所罗门和塞萨，未发表）不同的敏感性。因此，它是最好的测试效应（S）在不同的酵母菌株的兴趣。
二。酵母媒体的制备
不包含任何载体，使用YPD（10 g / L酵母提取物，20 g / L的蛋白胨，2％W / V]葡萄糖）作为生长介质中的酵母菌株的生长。对于固体培养基，添加2％的解决方案（如果是非常柔软的固体培养基，添加0.05％[V / V]从5 N氢氧化钠原液中型高压灭菌前）[W / V]琼脂。我们建议准备无葡萄糖介质最终体积的90％和高压灭菌。不久之前使用，填补一个过滤器消毒的20％W / V]的葡萄糖溶液（20％葡萄糖溶液保持在4 ° C，以防止污染）的100％的体积。
酵母菌株含有一个载体，提供prototrophy选择标记（亮氨酸，尿嘧啶，组氨酸或色氨酸）的增长，使用不亮氨酸合成辍学的媒介，尿嘧啶，组氨酸和色氨酸（6.7 g / L酵母无氨基酸氮基，1.4 g / L酵母合成辍学中等补充）[W / V]葡萄糖或2％W / V]半乳糖和1％[W / V]棉子糖，含2％。对于固体培养基，添加2％W / V]琼脂的解决方案。我们建议准备在最终体积的90％的中等和高压灭菌。不久，在使用前，填写一个过滤器消毒的20％葡萄糖溶液，或过滤灭菌的半乳糖20％+ 10％棉子糖的解决方案取决于所需的碳源（保持20％的葡萄糖和20％，100％的体积半乳糖+ 10％棉子解决方案，在4 ° C，以防止污染）。根据选择标记的表达载体器，使用前（10毫升/ 1 g/100毫升亮氨酸股票大号，大号10毫升/ 200毫克毫升尿嘧啶股票，2毫升/ L，从1 g/100添加其他氨基酸或尿嘧啶毫升组氨酸的股票，或2毫升/升）从1 g/100毫升色氨酸股票。当准备亮氨酸和尿嘧啶的股票，通过高压灭菌消毒，并保持室温。筹备组氨酸和色氨酸股票时，通过过滤消毒，包装用铝箔，以防止光的瓶子，并保持在4 ° C。在程序所述，辅以与亮氨酸合成辍学介质，尿嘧啶，组氨酸和色氨酸被指定为合成完全培养基。
固体介质板可以存储长达两个月，在4 ° C使用前，在无菌的层流罩在室温为20分钟的干板。
三。酵母转化
- 酵母转化过程开始之前，准备好以下三个解决方案：50％W / V]聚乙二醇（PEG）3350解决方案，1米LiAc溶液的pH值= 8.0，和TE溶液（100毫米的Tris pH值= 6.85 10 mM EDTA的pH值= 8.0）。过滤消毒的解决方案，并保持在4 ° C。
- 使用长木轴或无菌接种环，挑一个酵母细胞集落（直径1-2毫米），并从一个全新的板块，在15毫升的聚丙烯管接种3毫升YPD。涡简要。培养管放置在滚筒和孵化在30℃不断旋转的隔夜。
- 在早上，取出在室温下5分钟离心辊和800克的文化。离心后，彻底去除上清。
- 重悬在1毫升的再悬浮缓冲液（10％[V / V] TE溶液，10％[V / V] 1米LiAc解决方案），由涡旋混合的细胞。
- 对于每个要转化质粒和一个额外的控制改造，100μL的细胞悬液转移到微管。
- 每管中，加入5μL单链鲑鱼精子DNA（10毫克/毫升）的质粒DNA转化（为控制管除外）和250-500纳克。
- 认真添加到转换解决方案（10％，80％的50％[V / V] [W / V] PEG解决方案[V / V] TE溶液，10％[V / V] 1米LiAc解决方案的每管650μL ）和旋涡。
- 在30 ° C下孵育30分钟滚筒。
- 从摇床中取出试管，加入70μL的DMSO，反相管组合的10-15倍（不旋涡，以避免破坏细胞）。
- 管放置在42 ° C预温水浴孵育15分钟。
- 从水浴中取出试管，立即置于冰上2分钟。
- 管一旦冷却下来，离心800克，在室温下5分钟。
- 采取的离心管，并仔细清除粘性上清使用移液器。
- 每管细胞沉淀重悬于150μL无菌双蒸水（DDW），传播一种人工合成的完全培养基含2％葡萄糖作为碳源板和无细胞悬液的氨基酸或核苷酸质粒提供prototrophy。
- 离开板2分钟打开，让他们干层流罩。两三天的板放置在30℃培养箱。
- 一旦菌落（直径1-2毫米）板块出现，挑选每个改造的约10个单菌落，他们转移到一个新的板块。当转移的殖民地，使2厘米× 2厘米的补丁，让大量的酵母细胞的增长。两天，在30 ° C孵育孵化器板。
- 当酵母补丁已经长大，从孵化器中取出的板，并用封口膜密封。板可以被保存在4 ° C转移到一个新的板，每10-14天的殖民地。
四。准备酵母蛋白提取物，以验证免疫印迹效应表达
- 选择适当的合成完整的与2％葡萄糖作为碳源的培养基中含有3毫升15毫升的聚丙烯管，从一个全新的板块没有的氨基酸或核苷酸的质粒的酵母殖民地（直径1-2毫米）提供选择prototrophy。培养管放置在滚筒和孵化在30 ° C过夜
- 在次日，从滚筒中删除的文化和800克离心机在室温下5分钟。取出离心管上清液。
- 重悬细胞沉淀在3毫升无菌DDW和涡旋混合。
- 再次离心，弃上清，悬浮细胞，在无菌DDW 3毫升。
- 200μL的细胞悬液转移到一个新的含有半乳糖2％和1％的棉子糖作为碳源的培养基中合成完整的3毫升15毫升管，没有的氨基酸或核苷酸，质粒的选择提供prototrophy。混合震荡，在滚子的地方，和孵化一夜之间在30 ° C。
- 在第二天早上，1毫升的文化（或低密度文化）转移到微管。收获800克的细胞在室温下5分钟离心。
- 从这里开始，工作在通风橱中，以避免吸入有毒气体β-巯基乙醇。小心取出上清液使用移液器，在冰冷的裂解液100μL（4％[V / V] 5 N氢氧化钠，0.5％[V / V]β-巯基乙醇），重悬细胞沉淀。混合大力涡旋，并在冰上孵育30分钟。
- 在孵化期间，确定100μl裂解缓冲液pH值9-10的滴定所需的HCl体积（6 N）。为实现这一目标，10微管在机架和转移裂解液100μL到他们每个人。添加盐酸（6个N）各卷（1-10μL），以每管和涡旋混合。取一次样，检查的使用酸碱指示剂条溶液的pH值。
- 孵化结束，添加量在上一步中的裂解和涡旋混合（更准确地放置在管方没有提示插入裂解盐酸溶液）确定的盐酸。
- 新增50个3倍样品缓冲液（30％[V / V]甘油，15％[V / V]β-巯基乙醇，37.5％[V / V] 500毫米的Tris - HCl pH值= 6.8，0.15％W / V ]十二烷基硫酸钠[SDS]和几粒溴酚蓝）震荡（如果溶液变为黄色，这意味着，pH值过低，应添加到解决方案和几微升裂解液的裂解和混合变为蓝色）。
- 煮沸5分钟后穿刺针的微管盖了一个洞的加热块上裂解解决方案。
- 微管加热块取出，并让溶液在室温下2分钟冷却。
- 涡裂解解决方案，然后旋转10秒。免疫印迹分析，装载到SDS - PAGE凝胶30μL。
五合模试验检测效应引起的生长抑制表型
- 从一个全新的板块中挑选一个酵母细胞集落（直径1-2毫米）携带表达质粒的利益和接种，在15毫升的聚丙烯管，3毫升2％葡萄糖作为碳源的培养基中合成完整的，没有的氨基酸酸或核苷酸，表达质粒提供prototrophy。重复相同的过程控制酵母携带空质粒的应变。文化管放置在滚筒和孵育30 ° C时不断旋转的隔夜。
- 在接下来的一天，从滚筒中删除的文化和离心机在800克，在室温下5分钟。取出离心管上清液。
- 重悬细胞沉淀在3毫升无菌DDW和涡旋混合。
- 重复离心步骤3毫升无菌DDW和悬浮细胞。
- 要确定他们的光密度（OD），每一种文化转移100μL含900微升DDW和旋涡到微管。倒入一个塑料比色皿管的内容和措施，在600 nm波长的吸光度（作为参考，使用1毫升DDW填补了比色皿）。试管文化OD 600乘以10的稀释倍数计算外径 600的初始文化。
- 其次，根据初步培养OD 600，准备用OD 600 = 1.0在无菌微管的细胞悬浮液（1毫升）。
- 通过使用900μL无菌DDW填充的3无菌微管，准备三个10倍连续稀释（ 外径 600 = 0.1，0.01和0.001），从每个细胞悬液（外径600 = 1.0）在上一步准备。
- 准备没有的氨基酸或核苷酸质粒的选择提供prototrophy含有合成完全培养基的两个板块。一个板块的中期应补充2％葡萄糖和半乳糖2％和1％的棉子糖等板块。干在室温下在无菌层流20分钟罩板和他们放在一个网格。
- 对于每一个文化，现货10的抑制和诱导媒体在连续四个稀释液。
- 察觉后，离开几分钟的引擎盖打开板。斑点，干燥，覆盖板，放置在30℃孵化器为2-3天。
- 孵育后，取出板和分析酵母生长。首先，确认细胞密度包含压制介质板类似。然后，比较文化的发展，表达效应蛋白与含有诱导培养基板上的一个空载体的文化的兴趣。
注：效应可能的目标，没有限速标准实验室生长条件下生长酵母细胞的过程。要允许的生长抑制表型鉴定等效应，诱导媒体与酵母细胞功能的改变的化合物，可以补充，从而增加其灵敏度效应。此过程中，都不可能将综合性化学品的清单，请参阅Parsons等。 （2004）2。
六。代表性的成果
代表酵母发现III型效应的表达诱导的生长抑制表型的检测和检测如图所示。 1。 HopAA1 - 1和革兰氏阴性植物病原细菌假单胞菌丁香光伏番茄（PST）AvrE1 III型效应AvrPto，在这个实验中，表达着丝粒中含有的酵母菌株BY4741质粒pGML10，并测试他们的能力以抑制酵母菌的生长。半乳糖诱导的GAL1启动子控制下表达PST III型效应，或包含一个空载体的个体酵母文化系列稀释，并镀上压制（葡萄糖）或诱导（半乳糖）媒体（图1）。在镇压介质，进行AvrPto和HopAA1 - 1的表达质粒的酵母菌株展出包含一个空向量的应变作为控制类似的增长。但在同一介质中，酵母携带AvrE1显示的增长略有减少，可能与某种程度渗漏的GAL1启动和AvrE1高的细胞毒作用。在诱导条件下，表达AvrE1效应引起的急剧增长抑制表型，反映在缺乏任何稀释的殖民地。 Munkvold等。3，HopAA1 - 1的表达也导致严重的抑制经济 增长，正如以前观察到的的，而AvrPto没有显示出任何效果。
图1。造成假单胞菌丁香光伏番茄表达的酵母生长的抑制作用（PST）III型效应AvrE1和HopAA1 - 1。酵母菌株（BY4741）的质粒pGML10，要么为空，或携带推动GAL1 -半乳糖诱导表达AvrPto录音带HopAA1 - 1或AvrE1，过夜合成完整的培养基（2％）与葡萄糖作为碳源，而且缺乏亮氨酸。文化分别洗净，标准化外径600发现到合成完整的固体媒体缺乏亮氨酸和含葡萄糖（2％），或半乳糖（2％）和棉子糖（1％）= 1.0，连续10倍稀释。照片后增长2和第3天在30 ° C分别增长酵母中的葡萄糖和半乳糖媒体，采取。
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Discussion
在此演示中，我们演示了如何使用芽殖酵母酿酒酵母作为III型细菌效应蛋白和如何识别效应诱导的生长抑制表型的表达异源系统。重要的是，这些表型可以利用遗传筛选，以确定的负面影响酵母生长的效应抑制器。抑制器可能代表无论是直接的效应研究的目标或蛋白质参与细胞过程的影响的效应。无数III型效应，从动物和植物细菌病原体在酵母中迄今已表示，生长抑制引起的表型，其中几个被用来识别过程或途径，他们的目标 1,4 。在几项研究中，还成功地利用酵母效应毒性，以确定新的 5细菌效应。此外，效应诱导的生长抑制表型可能被利用，为抑制的毒性效应在酵母6的化合物，化学库的屏幕药物发现。
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Acknowledgments
这项工作是由以色列科学基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212750 | |
| Peptone | Difco Laboratories | 211677 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco Laboratories | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | >99%; <0.1% glucose |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | R0250 | >98% |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| L-histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | Desiccate |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4958 | |
| Tris (base) | JT Baker | 4109-02 | |
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B6131 | |
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck & Co., Inc. | 8.22050.1000 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt Ltd | 67.742 | |
| Inoculation loop | Sigma-Aldrich | Z643009 | Sterile |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck & Co., Inc. | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
