Summary
Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure pour l'expression des effecteurs bactériens de type III chez la levure et l'identification des effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. Ces phénotypes peuvent ensuite être exploités pour élucider les fonctions effectrices et cibles.
Abstract
Beaucoup de bactéries pathogènes à Gram-négatif utilisent un système de sécrétion de type III de translocation d'une série de protéines effectrices dans le cytosol des cellules hôtes. Dans la cellule, le type III effecteurs subvertir les processus cellulaires de l'hôte à supprimer les réponses immunitaires et favorisent la croissance des pathogènes. De nombreux types d'effecteurs III de pathogènes végétaux et animaux de bactéries ont été identifiées à ce jour, mais seulement quelques-uns d'entre eux sont bien caractérisés. Comprendre les fonctions de ces effecteurs a été minée par une combinaison de redondance fonctionnelle dans le répertoire de l'effecteur d'une souche bactérienne donnée, les effets subtils qu'ils peuvent exercer à l'accroissement de la virulence, des rôles qui sont peut-être spécifiques à certaines étapes de l'infection, et des difficultés dans génétiquement manipuler certains agents pathogènes. Expression des effecteurs de type III dans la levure bourgeonnante
Protocol
I. Conception d'un système d'expression de levure pour les effecteurs de type III
Calibrage d'un système de levure appropriées pour l'expression de l'effecteur de type III (s) d'intérêt est une tâche importante et peut nécessiter quelques essais et erreurs. Facteurs de pertinence majeurs qui devraient être considérés et optimisés lors de la conception d'un tel système sont les suivants: 1) le promoteur dirigeant l'expression de l'effecteur (s), 2) le nombre de copies du gène effecteur, 3) la balise épitope utilisé pour vérifier l'expression des protéines et 4) la souche de levure.
1) Promoteur
Parce bactérienne de type III effecteurs peuvent être toxiques pour les cellules de levure, un promoteur inductible devrait être utilisé pour contrôler leur expression. Le promoteur GAL1 est couramment utilisé à cette fin et son activité est réglementée par la source de carbone présents dans le milieu de croissance: elle est réprimée par le glucose et induite par le galactose. Cependant, ce promoteur a été signalé comme légère fuite dans des conditions de réprimer entraînant une toxicité indésirable. Si un problème similaire est rencontré, il est conseillé de minimiser le nombre de copies du gène effecteur tel que décrit ci-dessous, ou d'utiliser des promoteurs inductibles alternatives, telles que l'MET3 ou CUP1 promoteurs 1. Nous décrivons ici les procédures pour exprimer des protéines effectrices à partir d'un promoteur inductible par le galactose.
2) Gène nombre de copies
Un paramètre supplémentaire qui affectent le niveau d'expression de protéines est le nombre de copies du gène effecteur présentes dans la cellule. Les niveaux d'expression élevés sont obtenus lorsque le gène effecteur est porté par un. Plasmidique de 2 microns (40-60 copies par cellule) Expression intermédiaire est obtenue en utilisant un centromère contenant plasmide (copies 1-3 par cellule), tandis qu'une expression faible est obtenu lorsque le gène effecteur est intégré dans le génome de la levure par recombinaison homologue. En combinant un vecteur centromère contenant et le promoteur GAL1 nous avons exprimé avec succès environ 50 effecteurs de pathogènes des plantes du Xanthomonas campestris pv. Vesicatoria et Pseudomonas syringae pv. Tomates à des niveaux détectables par analyse immunoblot et des fuites négligeables dans des conditions de réprimer (Salomon et Sessa , inédit).
3) Epitope Tag
Si des anticorps contre l'effecteur d'intérêt ne sont pas disponibles, un marqueur d'epitope est fusionnée à la protéine effectrice de surveiller son expression par immunoblot. Balises couramment utilisées sont Myc, l'hémagglutinine (HA) ou Drapeau, à laquelle fiables anticorps commerciaux sont disponibles. Nous vous suggérons d'utiliser une seule copie de l'étiquette afin de minimiser indésirables effets délétères sur la structure et l'activité de la protéine effectrice.
La souche de levure 4)
Une exigence fondamentale pour la souche de levure à être utilisé pour l'expression n'est auxotrophie au marqueur de sélection du vecteur d'expression. Il est important de noter que différentes souches de levure peut afficher des sensibilités différentes à l'expression des effecteurs de certains. Par exemple, nous avons observé que la BY4741 et W303 souches ont des sensibilités différentes à plusieurs Xanthomonas campestris pv effecteurs. Vesicatoria (Salomon et Sessa, inédit). Par conséquent, il est préférable de tester l'effecteur (s) d'intérêt dans différentes souches de levure.
II. Préparation des milieux de levure
Pour la croissance de souches de levure qui ne contient aucun vecteur, l'utilisation YPD (extrait de levure 10 g / L, 20 g / L de peptone et 2% [w / v] glucose) que le milieu de croissance. Pour les milieux solides, ajouter 2% [w / v] à la solution d'agar (si le support solide est très doux, ajouter 0,05% [v / v] d'une solution de NaOH 5 N stocks au milieu avant autoclavage). Nous recommandons la préparation du milieu sans glucose dans 90% du volume final et l'autoclavage. Peu de temps avant de l'utiliser, remplissez le volume à 100% avec un filtre stérilisé 20% [w / v] une solution de glucose (conservez la solution de glucose à 20% à 4 ° C pour éviter la contamination).
Pour la croissance de souches de levure contenant un vecteur qui permet à une prototrophie marqueur de sélection (la leucine, l'uracile, histidine ou du tryptophane), l'utilisation de synthèse abandon milieu sans leucine, l'uracile, histidine et tryptophane (6,7 g / L de base azotée de levure sans acides aminés , 1,4 g / L de levures synthétiques abandon supplément de milieu) et contenant 2% [w / v] glucose, ou de 2% [w / v] galactose et 1% [w / v] raffinose. Pour les milieux solides, ajouter 2% [w / v] à la solution d'agar. Nous recommandons la préparation du milieu de 90% du volume final et l'autoclavage. Peu de temps avant de l'utiliser, remplissez le volume à 100% avec une solution stérilisée par filtration de glucose à 20%, soit un galactose, stérilisée par filtration solution à 20% + 10% de raffinose, selon la source de carbone désiré (garder le glucose à 20% et les 20% galactose + solutions raffinose 10% à 4 ° C pour éviter la contamination). Selon le marqueur de sélection de l'expression de vecTor, ajouter les autres acides aminés ou l'uracile avant usage (10 ml / L à partir d'un stock de 1 g/100 ml leucine, 10 ml / L à partir d'un stock de 200 mg/100 ml uracile, 2 ml / L à partir d'un 1 g/100 stock de l'histidine ml ou 2 ml / L à partir d'un stock de 1 g/100 ml tryptophane). Lors de la préparation stocks leucine et l'uracile, de les stériliser par autoclavage et conserver à température ambiante. Lors de la préparation stocks histidine et du tryptophane, de les stériliser par filtrage, envelopper la bouteille avec une feuille d'aluminium pour protéger de la lumière, et de garder à 4 ° C. Dans les procédures décrites ci-dessous, synthétique abandon milieu supplémenté avec la leucine, l'uracile, histidine et tryptophane est désigné comme un milieu complet synthétique.
Solid-média plaques peuvent être stockées pendant un maximum de deux mois à 4 ° C. Avant utilisation, les plaques sèches pendant 20 min dans une hotte à flux laminaire stérile à température ambiante.
III. Transformation de la levure
- Avant de commencer la procédure de transformation de la levure, préparer les trois solutions suivantes: 50% [w / v] polyéthylène glycol (PEG) 3350 solution, une solution de pH 1 M LiAc = 8,0, et une solution de TE (Tris 100 mM pH = 6,85 et EDTA 10 mM pH = 8,0). Filtre-stériliser les solutions et de garder à 4 ° C.
- L'utilisation d'un long manche en bois ou une boucle d'inoculation stérile, prélever une colonie de levures (1-2 mm de diamètre) d'une plaque fraîche et inoculer 3 ml de YPD dans un tube en polypropylène de 15 ml. Brièvement au vortex. Placez le tube de culture dans un rouleau et laisser incuber une nuit à 30 ° C avec une rotation constante.
- Dans la matinée, retirez la culture du rouleau et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante. Après centrifugation, éliminer complètement le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans une tampon de resuspension ml (10% [v / v] TE solution, 10% [v / v] 1 M LiAc solution) et mélanger au vortex.
- Pour chaque plasmide d'être transformé et une transformation de contrôle supplémentaires, le transfert de 100 pi de la suspension de cellules dans un microtube.
- Pour chaque tube, ajouter 5 l de brin de l'ADN du sperme de saumon seule (10 mg / ml) et 250 à 500 ng d'ADN plasmidique d'être transformé (sauf pour le tube de contrôle).
- Soigneusement ajouter à chaque tube 650 ul de la solution de transformation (10% [v / v] TE solution, 10% [v / v] 1 M LiAc solution, 80% [v / v] de 50% [w / v] solution de PEG ) et vortex.
- Incuber à 30 ° C pendant 30 min sur un rouleau.
- Retirer les tubes de l'agitateur, ajouter 70 ul de DMSO, et mélanger en retournant les tubes 10-15 fois (ne pas vortexer pour éviter de casser les cellules).
- Placer les tubes dans un bain de 42 ° C l'eau préchauffé et incuber pendant 15 min.
- Retirer les tubes du bain-marie et les placent immédiatement sur la glace pendant 2 min.
- Une fois les tubes sont refroidis, les centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante.
- Prenez les tubes de la centrifugation et retirer délicatement le surnageant visqueux à l'aide d'une pipette.
- Resuspendre la cellule de chaque tube culot dans 150 pl de l'eau distillée stérile double (DDW), et la propagation de la suspension cellulaire sur une plaque support synthétique complet contenant 2% de glucose comme source de carbone et sans acides aminés ou de nucléotides dont le plasmide fournit prototrophie.
- Laisser les plaques ouverte pendant 2 min et laissez-les sécher dans une hotte à flux laminaire. Placer les plaques dans un incubateur à 30 ° C pendant deux-trois jours.
- Une fois que les colonies (1-2 mm de diamètre) sont apparus sur les plaques, ramasser environ 10 colonies uniques de chaque transformation et de les transférer sur une plaque fraîche. Lors du transfert des colonies, faire 2 cm x 2 cm correctifs pour permettre la croissance d'une grande quantité de cellules de levure. Incuber les plaques dans un incubateur à 30 ° C pendant deux jours.
- Lorsque les plaques de la levure ont grandi, enlever les plaques de l'incubateur et les sceller avec du parafilm. Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C. Transfert des colonies sur une plaque de frais tous les 10-14 jours.
IV. Préparation d'une protéine extrait de levure pour vérifier l'expression effectrices par immunoblot
- Choisissez une colonie de levures (1-2 mm de diamètre) d'une plaque de frais à un tube en polypropylène de 15 ml contenant 3 ml du milieu approprié synthétique complet complété avec 2% de glucose comme source de carbone et sans acides aminés ou de nucléotides dont le plasmide de choix fournit prototrophie. Placez le tube de culture dans un rouleau et laisser incuber une nuit à 30 ° C.
- Dans le lendemain, retirez la culture du rouleau et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer les tubes de la centrifugeuse et jeter le surnageant.
- Reprendre le culot cellulaire dans 3 ml de DDW stérile et mélanger au vortex.
- Centrifuger de nouveau, jeter les cellules surnageant et remettre en suspension dans 3 ml de DDW stérile.
- Transférer 200 ul de la suspension cellulaire à un nouveau tube de 15 ml contenant 3 ml de milieu synthétique complet complété avec 2% de galactose et le raffinose 1% comme source de carbone, et sans les acides aminés ou de nucléotides dont le plasmide de choix fournit prototrophie.Mélanger au vortex, le placer dans un rouleau, et incuber une nuit à 30 ° C.
- Dans la matinée suivante, transférer 1 ml de la culture (ou plus pour les cultures à faible densité) dans un microtube. Récolter les cellules par centrifugation à 800 g pendant 5 min à température ambiante.
- A partir de là, travailler dans une hotte pour éviter de respirer β-mercaptoéthanol vapeurs toxiques. Retirer délicatement le surnageant aide d'une pipette et remettre le culot cellulaire dans 100 ul d'une solution glacée de lyse (4% [v / v] 5 N NaOH, 0,5% [v / v] β-mercaptoéthanol). Mélanger vigoureusement au vortex et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Durant l'incubation, déterminer le volume de HCl (6 N) nécessaire pour titrage 100 ul de tampon de lyse à pH 9-10. Pour ce faire, placer 10 microtubes dans un rack et le transfert 100 ul du tampon de lyse dans chacun d'eux. Ajouter des volumes différents (1-10 pi) de HCl (6 N) à chaque tube et mélanger au vortex. Prélever un échantillon et vérifier le pH de la solution en utilisant un papier indicateur de pH.
- A la fin de l'incubation, ajouter le volume de HCl déterminée dans l'étape précédente au lysat et mélanger au vortex (pour une meilleure précision, placer la solution de HCl sur le côté du tube sans insérer l'embout dans le lysat).
- Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon 3x (30% [v / v] glycérol, 15% [v / v] β-mercaptoéthanol, 37,5% [v / v] 500 mM Tris-HCl pH = 6,8, 0,15% [p / v ] de sodium dodécyl sulfate de [SDS] et quelques grains de bleu de bromophénol) au lysat et mélanger au vortex (si la solution vire au jaune, cela signifie que le pH est trop bas, et quelques microlitres de solution de lyse doit être ajouté jusqu'à ce que la solution devient bleu).
- Faire bouillir la solution lysat pendant 5 minutes sur un bloc de chauffage après la perforation d'un trou dans le couvercle du microtube avec une aiguille.
- Retirer le microtube à partir du bloc de chauffage et de laisser la solution refroidir pendant 2 min à température ambiante.
- Vortex solution lysat puis le tourner pendant 10 sec. Charge 30 ul sur un gel SDS-PAGE pour l'analyse immunoblot.
V. Spotting test pour détecter Effector induite Phénotypes inhibition de la croissance
- Partir d'une plaque fraîche choisir une colonie de levure (1-2 mm de diamètre) portant le plasmide d'expression d'intérêt et d'inoculer, dans un tube de 15 ml en polypropylène, 3 ml de milieu synthétique complet complété avec 2% de glucose comme source de carbone et sans l'aminé acide ou nucléotide à laquelle le plasmide d'expression fournit prototrophie. Répétez la même procédure pour une souche de levure de contrôle portant un plasmide vide. Placer les tubes de culture dans un rouleau et laisser incuber une nuit à 30 ° C avec une rotation constante.
- Dans le lendemain, retirez les cultures du rouleau et centrifuger à 800 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer les tubes de la centrifugeuse et jeter le surnageant.
- Reprendre le culot cellulaire dans 3 ml de DDW stérile et mélanger au vortex.
- Répéter l'étape de centrifugation et de remettre les cellules dans 3 ml de DDW stérile.
- Afin de déterminer leur densité optique (DO), transfert de 100 ul de chaque culture dans un microtube contenant 900 ul DDW et le vortex. Verser le contenu des tubes dans une cuvette en plastique et de mesurer l'absorbance à une longueur d'onde de 600 nm (utiliser comme référence une cuve remplie de 1 ml de DDW). Calculer la DO 600 des cultures initiales en multipliant la DO 600 de la culture dans la cuvette par un facteur de dilution de 10.
- Ensuite, sur la base des DO 600 de la culture initiale, préparer des suspensions de cellules (1 ml) avec une DO 600 = 1,0 dans des microtubes stériles.
- En utilisant 3 microtubes stériles remplis avec 900 ul DDW stériles, préparer trois 10 dilutions successives (DO600 = 0,1, 0,01 et 0,001) de chaque suspension cellulaire (DO 600 = 1,0) préparé dans l'étape précédente.
- Préparer deux plaques contenant un milieu complet synthétique sans les acides aminés ou de nucléotides dont le plasmide de choix fournit prototrophie. Le milieu d'une plaque doit être complété par 2% de glucose et celle de l'autre plaque avec 2% de galactose et le raffinose 1%. Sécher les plaques dans une hotte à flux laminaire stérile à température ambiante pendant 20 minutes et les placer sur une grille.
- Pour chaque culture, spot de 10 pi de quatre dilutions dans une rangée sur deux répression et induire des médias.
- Après avoir repéré, laisser les plaques ouverte dans la hotte pendant plusieurs minutes. Lorsque les taches sont sèches, couvrir les plaques et les placer dans un incubateur à 30 ° C pendant 2-3 jours.
- Après incubation, sortir les plaques et d'analyser la croissance de la levure. Tout d'abord, confirmer que les densités cellulaires sont similaires sur la plaque contenant le milieu de réprimer. Ensuite, comparer la croissance de la culture exprimant la protéine effectrice d'intérêt avec la culture portant un vecteur vide sur la plaque contenant le milieu d'induction.
Note: les effecteurs peuvent cibler les processus cellulaires qui ne sont pas de limitation de vitesse à la croissance de la levure dans des conditions standard de croissance du laboratoire.Afin de permettre l'identification des phénotypes d'inhibition de croissance pour ces effecteurs, les médias induisant peut être complétée avec des composés qui modifient les fonctions cellulaires de la levure, ce qui augmente leur sensibilité aux effecteurs. Pour une liste des produits chimiques qui peuvent éventuellement être intégrés dans cette procédure, reportez-vous à Parsons et al. (2004) 2.
VI. Les résultats représentatifs
Une levure représentant spotting dosage et la détection des phénotypes d'inhibition de croissance induite par l'expression des effecteurs de type III sont présentés sur la Fig. 1. Dans cette expérience, le type III effecteurs AvrPto, HopAA1-1 et de l'AvrE1 Gram négatif bactérie phytopathogène Pseudomonas syringae pv. Tomate (Pst) ont été exprimés de la pGML10 centromère contenant plasmide dans la souche BY4741 levure, et testés pour leur capacité pour inhiber la croissance des levures. Cultures de levures de type individuel exprimer Pst effecteurs III sous le contrôle de l'inductible galactose promoteur GAL1 ou contenant un vecteur vide ont été dilués en série et étalées sur la répression (glucose) ou induire (galactose) médias (Fig. 1). Sur réprimer moyennes, souches de levure portant des plasmides pour l'expression de AvrPto et HopAA1-1 ont présenté une croissance similaire à la souche témoin contenant un vecteur vide. Toutefois, sur le même milieu, de levure portant AvrE1 affiché une croissance légèrement réduite, probablement liée à un certain degré de fuite du promoteur GAL1 et à l'effet cytotoxique de haute AvrE1. Dans des conditions induisant l'expression de l'effecteur AvrE1 provoqué un phénotype de croissance drastique l'inhibition traduit par le manque de colonies dans toute dilution. Comme précédemment observé par Munkvold et al. 3, l'expression de HopAA1-1 a également entraîné une inhibition sévère de la croissance, tandis que AvrPto n'ont montré aucun effet.
Figure 1. Inhibition de la croissance de levures causées par l'expression de la Pseudomonas syringae pv. Tomate (Pst) de type III AvrE1 effecteurs et HopAA1-1. Souches de levure (BY4741) contenant le plasmide pGML10, vides ou transportant GAL1 axée cassettes pour la galactose-expression inductible de l'AvrPto , HopAA1-1 ou AvrE1, ont été cultivées pendant une nuit dans du milieu complet synthétique supplémenté en glucose (2%) comme source de carbone, et manquant de leucine. Les cultures ont été lavées, normalisées à DO600 = 1,0 et 10 série de dilutions ont été déposés sur un milieu solide synthèse complète manquent leucine et contenant du glucose (2%), ou le galactose (2%) et le raffinose (1%). Les photographies ont été prises après 2 et 3 jours de croissance à 30 ° C pour les levures de plus en plus de glucose et de galactose des médias, respectivement.
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Discussion
Dans cette présentation, nous avons illustré la façon d'utiliser la levure Saccharomyces cerevisiae comme un système hétérologue pour l'expression de type III bactérienne des protéines effectrices et comment identifier les effecteurs induits phénotypes inhibition de la croissance. Surtout, ces phénotypes peuvent être utilisées dans les écrans de génétique pour identifier des suppresseurs de l'impact négatif sur la croissance des effecteurs de la levure. Suppresseurs peuvent représenter soit des cibles directes de l'effecteur étudié ou protéines qui participent à des processus cellulaires affectés par l'effecteur. De nombreux types d'effecteurs III de pathogènes bactériens animales et végétales ont été exprimés dans la levure à ce jour, et les phénotypes d'inhibition de croissance causée par plusieurs d'entre eux ont été utilisés pour identifier les processus ou les voies que le 1,4 cible qu'ils. Dans plusieurs études, la toxicité effecteur dans la levure a également été exploitées avec succès pour identifier de nouveaux effecteurs bactériens 5. Par ailleurs, l'effecteur induit des phénotypes d'inhibition de croissance peuvent être exploitées pour la découverte de médicaments dans les écrans des chimiothèques de composés qui suppriment la toxicité des effecteurs dans la levure 6.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation sciences d'Israël.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212750 | |
| Peptone | Difco Laboratories | 211677 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Agar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco Laboratories | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplement | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | >99%; <0.1% glucose |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | R0250 | >98% |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| L-histidine | Sigma-Aldrich | H6034 | |
| DNA, single stranded, from salmon testes | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879 | Desiccate |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Lithium acetate (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4958 | |
| Tris (base) | JT Baker | 4109-02 | |
| Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B6131 | |
| Dodecyl sulfate sodium salt (SDS) | Merck & Co., Inc. | 8.22050.1000 | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430052 | Sterile |
| Spectrophotometer cuvette (10x4x45 mm) | Sarstedt Ltd | 67.742 | |
| Inoculation loop | Sigma-Aldrich | Z643009 | Sterile |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7543 | |
| pH indicator strip, pH 6.5-10.0 | Merck & Co., Inc. | 1.09543.0001 |
References
- Siggers, K. A., Lesser, C. F. The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins. Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).
- Parsons, A. B. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).
- Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. Yeast as a tool to study bacterial effectors. Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).
- Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins. PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).
- Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth. Nature. 456, 112-115 (2008).
