组织者和动物极植从非洲爪蟾胚胎和装配一个细胞粘附实验的剖析

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

Souichi Ogata¹, Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

本视频演示所使用的技术准备从非洲爪蟾胚胎，包括使用的眉刀的组织者和动物极植 - 一个专门的清扫工具的眉。也给出了组装粘附实验的协议，目前表面上的组织者或动物极细胞，适当发展的关键，关键粘附分子的存在探头。

Protocol

准备附着力钱伯斯（前一天注射/夹层）

黏附实验房

如果你有一个传统的复合式显微镜（舞台上方的光学定位），它是ncecessary低高度粘连室如下。如果使用倒置光学显微镜，然后“NUNC实验室TEK腔玻璃罩”可以被使用，并跳过步骤＃1 - 2。

附上“压密封的硅绝缘体”40 x 24毫米盖玻片之一。用力按下绝缘体清洁台式盖玻片，从另一个侧面看，以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。
可选：将粘附在一个玻璃的Petri盘的Whatman滤纸和干燥周期中的反应釜消毒室。冷却下来到RT。

涂总商会

把200毫升液滴的钙粘蛋白（10mg/ml的）或纤维连接蛋白（20mg/ml）到蒸压粘连室的中心工作的解决方案，使用sigmacoated黄芽。在室温下孵育4小时。
取出的钙粘蛋白或纤维连接蛋白解决方案，并转移到1.5ml管。未来两个星期内，该解决方案可重复使用。
免除1X按揭证券 - H 500ml的4％BSA块室。在室温下孵育1小时。
吸BSA溶液。 500毫升1X MBS - H的清洗室两次。第二次洗涤后，吸出的MBS - H的大部分（不完全），并储存在密封容器内4℃这粘连商会是在未来2 - 3天。

动物第植体解剖和离解

孵育0.1倍MBS - H的注入胚胎，从蒸压1X按揭证券- H的稀释，非蒸压中期的某个时候进行小的细菌，可以扰乱分离的动物上限细胞。
60毫米菜1X巴特的琼脂糖板和CMF -按揭证券琼脂糖板，至少为样品的数量很多。蒸压1X MBS - H倒入1X巴特的板块。 CMF -按揭证券板块，倒入10毫升CMF -按揭证券。
当胚胎成为8.5阶段，开始在1X巴特板解剖的动物帽。 10 - 15％的样品植通常就足够了一项实验。
将动物第植到CMF的按揭证券板块。育植的45 - 60分钟，直到植是完全分离的。在每15分钟的温和鼓动将有助于解离。

细胞粘附实验

播种细胞：分装500毫升1X按揭证券 - H以上的部分，粘附实验分庭和涂料商会的步骤准备粘附室。传输从CMF的按揭证券板块的分离的动物第细胞粘附室使用一个sigmacoated和切碎黄芽P200。
可选：如果可能的话，小心吸中期约2 / 3中途不暴露在空气中的细胞，。新增大约相同数量的新鲜MBS - H，以确保中期含有足够的钙^{2 +}和Mg ^{2 +。}
在室温下孵育45 - 90分钟。偶尔检查细胞，看看他们是否附加的底部表面。
现在你可以利用细胞在显微镜下的图片。
把网格载玻片上的附着力室。对齐粘附室的角落之一电网幻灯片的一个角落。点算并记录在几个不同的网格的贴壁细胞数量。
倒在一个大塑料桶（例如，特百惠等）的MBS - H 1L。轻轻把粘附幻灯片室桶的底部。旋转的轨道摇床在低速（50 - 60rpm）5分钟。
把粘连室对电网的幻灯片，调整室的角落电网幻灯片相同的角落，在本节中，细胞粘附实验步骤＃5。计数保持在同一电网连接，你有洗涤之前算细胞数目。计算保持后洗去附着的细胞的百分比。

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting