Dissekering av Organizer och Animal explants Pole från Xenopus laevis Embryon och församlingen i en cell Adhesion analys

Summary

Denna video visar den teknik som används för beredning av arrangör och djur explants pol från Xenopus laevis embryon, inklusive användningen av ögonbrynet kniv - en specialiserad dissektion verktyg gjorda av ens ögonbrynet. Protokollet för montering en vidhäftning analys ges också, som sonder för förekomst av viktiga adhesionsmolekyler finns på ytan arrangören eller djurceller pol som är kritiska för korrekt utveckling.

Protocol

Förbereda Vidhäftning Chambers (dagen före injektionen / dissekering)

Vidhäftning analys Chambers

Om du har en vanlig sammansatt mikroskop (optisk lokaliserar ovanför scenen) är det ncecessary att göra en låg höjd vidhäftning kammare enligt följande. Om du använder den inverterade-optik mikroskop, sedan "NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass" bara kan användas, och hoppa över steg # 1 - 2.

1. Fäst en "tryck-till-tätning kisel isolator" på en 40 x 24 mm täckglas. Ordentligt tryck på isolator i locket halka på ren bänk och titta från andra sidan att se till att isolatorn är ordentligt utan luftbubblor.
   
   
2. Tillval: Sätt vidhäftning kamrarna i ett glas petriskål med Whatman filterpapper och autoklavera i torr-cykel att sterilisera. Kyl ner dem till RT.

Beläggning kammaren

1. Sätt en 200 ml droppe brukslösning av cadherin (10mg/ml) eller fibronektin (20mg/ml) på mitten av en autoklaveras vidhäftning kammare, med hjälp av sigmacoated gula tips. Inkubera vid RT i 4 timmar.
   
   
2. Ta ut cadherin eller fibronektin lösning och överför till en 1,5 ml rör. Denna lösning kan återanvändas för nästa två veckor.
   
   
3. Tillsätt 500 ml på 4% BSA i 1x MBS-H för att blockera kammaren. Inkubera vid RT i 1 timme.
   
   
4. Aspirera BSA lösningen. Tvätta kammare med 500 ml 1X MBS-H två gånger. Efter den andra tvättar, aspirera flesta av MBS-H (inte helt), och förvara i en sluten behållare vid 4 º C. Denna vidhäftning kammare är bra för de närmaste 2 - 3 dagar.

Dissekering och dissociation av explants Animal Cap

1. Inkubera den injicerade embryon i 0,1 x MBS-H, efter utspädning från autoklaveras 1x MBS-H, som icke autoklaveras medelstora gång bär små bakterier som kan störa dissocierade djurceller mössa.
   
   
2. Gör 1x Barth agaros tallrikar och CMF-MBS agaros plåtar med 60mm rätter, minst lika många som antalet dina prover. Häll autoklaveras 1x MBS-H till 1x Barth plattor. För CMF-MBS tallrikar, häll 10 ml av CMF-MBS.
   
   
3. När embryona blir scenen 8,5, börja dissekera djuret mössor i en 1x Barth tallrik. 10 till 15 explants per prov är oftast tillräckligt för ett experiment.
   
   
4. Överför explants djuret locket till en CMF-MBS plåt. Inkubera explants i 45 - 60 minuter tills explants är helt dissocierade. Gentle agitationer i varje 15 minuter hjälper dissociation.

Cell Adhesion analys

1. Sådd cellerna: Fördela 500ml 1x MBS-H till vidhäftning kammaren upprättats i stegen i avsnitten ovan, vidhäftning Chambers analys och Coating kammaren. Överför dissocierade djurceller locket från CMF-MBS plattan vidhäftningen kammaren med hjälp av P200 med en sigmacoated och avhuggna gult tips.
   
   
2. Valfritt: Om möjligt, försiktigt suga upp på medellång upp till ca 2 / 3 till hälften, utan att utsätta celler till luften. Tillsätt ungefär samma mängd färsk MBS-H, för att kontrollera att mediet innehåller tillräckligt med Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +.}
   
   
3. Inkubera vid RT för 45 - 90 minuter. Kontrollera att cellerna då och då för att se om de är knutna till botten ytan.
   
   
4. Nu kan du ta en bild av cellerna i mikroskop.
   
   
5. Sätt vidhäftning kammaren på ett rutnät bild glas. Rikta ett av hörnen på vidhäftning kammaren till ett hörn av nätet bilden. Räkna och registrera antalet bifogade cellerna i flera olika nät.
   
   
6. Häll 1L av MBS-H i en stor plasthink (t.ex. Tupperware, etc.). Försiktigt sätta vidhäftning bilden kammare i botten av hinken. Vrid den på skakapparat i fem minuter på låg hastighet (50 - 60rpm).
   
   
7. Sätt vidhäftning kammare tillbaka på nätet bilden, rikta samma hörn av kammaren till samma hörn av nätet bilden, såsom gjordes i steg # 5 i detta avsnitt, Cell Adhesion analys. Räkna antalet celler som sitter kvar på samma rutnät som du har räknat innan tvätt. Beräkna procentandelen av celler som sitter kvar efter tvätt.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting