Biology

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Questo video mostra la tecnica utilizzata per la preparazione di organizzatore e di espianti polo animale da embrioni di Xenopus laevis, compreso l'uso del coltello sopracciglio - uno strumento specializzato in dissezione della propria sopracciglio. Il protocollo per l'assemblaggio di un test di adesione è data anche, che le sonde per la presenza di molecole di adesione chiave presenti sulla superficie o organizzatore cellule polo animale che sono fondamentali per un corretto sviluppo.

Protocol

Preparazione Chambers Adesione (il giorno prima l'iniezione / dissezione)

Adesione saggio Chambers

Se si dispone di un microscopio convenzionale composto (localizza ottica sopra il palco), è ncecessary fare una bassa altezza camera di adesione come segue. Se si utilizza il microscopio invertito-ottica, poi "NUNC Lab-Tek vetrino Chambered" può solo essere usato, e saltare i passaggi # 1 - 2.

Collegare uno dei "press-per sigillare-isolante silicio" su un 24 millimetri x 40 vetrino. Premere con decisione l'isolatore allo scorrimento coperchio sul banco di lavoro pulito e guardare dall'altra parte per assicurarsi che l'isolante sia completamente inserito, senza bolle d'aria.
Optional: Mettere le camere adesione in un piatto di vetro Petri con carta Whatman filtro e autoclave a secco a ciclo per la sterilizzazione. Raffreddarli a RT.

Rivestimento della Camera

Mettere una goccia da 200 ml di soluzione di lavoro di caderina (10 mg) o fibronectina (20mg/ml) sul centro di una camera di adesione in autoclave, utilizzando sigmacoated punte gialle. Incubare a temperatura ambiente per 4 ore.
Estrarre la soluzione caderina o fibronectina e trasferirli in un tubo di 1,5 ml. Questa soluzione può essere riutilizzati per successive due settimane.
Dispensare 500 ml del 4% BSA in 1x MBS-H per bloccare la camera. Incubare a RT per 1 ora.
Aspirare la soluzione di BSA. Lavare la camera con 500ml di 1x MBS-H due volte. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte di MBS-H (non completamente), e conservare in un contenitore sigillato a 4 ° C. Questa camera di adesione è un bene per i prossimi 2 - 3 giorni.

Dissezione e dissociazione di espianti Cap Animale

Incubare gli embrioni iniettati in 0.1x MBS-H, diluito in base al autoclave 1x MBS-H, in quanto non in autoclave medio porta a volte piccoli germi che possono disturbare il dissociato cellule tappo animali.
Fai 1x Barth agarosio piatti e CMF-MBS piastre di agarosio con piatti 60mm, almeno tante quanto il numero dei tuoi campioni. Versare autoclave 1x MBS-H per le piastre 1x Barth. Per CMF-MBS piatti, versare 10 ml di CMF-MBS.
Quando gli embrioni diventano palcoscenico 8,5, avviare sezionare i tappi animale in lamiera uno Barth 1x è. 10-15 espianti per i campioni sono di solito sufficienti per un esperimento.
Trasferire il espianti animali tappo ad un CMF-MBS piatto. Incubare la espianti per 45 - 60 minuti fino a quando la espianti sono completamente dissociati. Agitazioni delicato in ogni 15 minuti aiuterà la dissociazione.

Adesione cellulare Assay

Semina delle cellule: Dispensare 500 ml di 1x MBS-H alla camera di adesione preparati nella procedura descritta nelle sezioni di cui sopra, Chambers Assay Adesione e rivestimento della Camera. Trasferire il dissociato cellule animali tappo dalla CMF-MBS piastra alla camera di adesione utilizzando P200 con punte sigmacoated e tritate-off giallo.
Facoltativo: se possibile, con attenzione succhiano il supporto fino a circa 2 / 3 a metà strada, senza esporre le cellule all'aria. Aggiungere circa la stessa quantità di fresco MBS-H, per assicurarsi che il terreno contiene sufficiente Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
Incubare a RT per 45 - 90 minuti. Controllare le cellule di tanto in tanto per vedere se sono connessi con la superficie inferiore.
Ora è possibile scattare la foto delle cellule al microscopio.
Porre la camera di adesione su un vetrino griglia. Allineare uno degli angoli della camera di adesione a un angolo della diapositiva griglia. Contare e registrare il numero delle cellule allegata in varie griglie.
Versare 1L di MBS-H in un secchio di plastica di grandi dimensioni (ad esempio, Tupperware, ecc.) Delicatamente la camera di scorrimento adesione al fondo del secchio. Ruotare sul agitatore orbitale per cinque minuti a bassa velocità (50 - 60rpm).
Porre la camera di adesione indietro sulla griglia di scorrimento, allineando stesso angolo della camera verso l'angolo della diapositiva stessa griglia, come è stato fatto nel punto # 5 del presente, di analisi cellulare sezione Adesione. Conta il numero di cellule che rimangono attaccati sulla stessa griglia che avete contato prima del lavaggio. Calcolare la percentuale di cellule che rimangono attaccati dopo il lavaggio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting