Biology

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo's, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes - een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Protocol

Voorbereiden Hechting Chambers (de dag vóór de injectie / dissectie)

Hechting Assay Chambers

Als u een conventionele samengestelde microscoop (optische lokaliseert boven het podium), is het ncecessary om een lage hoogte hechting kamer als volgt. Bij gebruik van de omgekeerde-optiek microscoop, dan "NUNC Lab-Tek Chambered dekglaasje" kan gewoon worden gebruikt, en sla de stappen # 1 - 2.

Bevestig een van de "pers-to-seal silicium isolator" op een 40 x 24 mm dekglas. Druk stevig op de isolator om de dekglas op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen.
Optioneel: Doe de hechting kamers in een glazen petrischaal met een Whatman filter papier en autoclaaf in droge-cyclus te steriliseren. Cool hen naar RT.

Coaten van de Kamer

Doe een 200ml druppel van de werkoplossing van cadherine (10mg/ml) of met fibronectine (20mg/ml) op het midden van een autoclaaf hechting kamer, met behulp van sigmacoated geel tips. Incubeer bij RT gedurende 4 uur.
Haal de cadherine of met fibronectine oplossing en transfer naar een 1,5 ml buis. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor de komende twee weken.
Doseer 500 ml van 4% BSA in 1x MBS-H naar de kamer te blokkeren. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.
Zuig het BSA-oplossing. Was de kamer met 500ml 1x MBS-H twee keer. Na de tweede wasbeurt, zuigen de meeste van de MBS-H (niet volledig), en op te slaan in een gesloten verpakking bij 4 º C. Deze hechting kamer is goed voor de komende 2 - 3 dagen.

Dissectie en dissociatie van Animal Cap Explantaten

Incubeer de geïnjecteerde embryo's in 0.1x MBS-H, verdund van de geautoclaveerde 1x MBS-H, als niet-geautoclaveerde medium ergens draagt weinig kiemen die kunnen verstoren de gedissocieerde dier dop cellen.
Maak 1x Barth's agarose platen en CMF-MBS agarose platen met 60mm gerechten, minstens evenveel als het aantal van uw monsters. Giet geautoclaveerd 1x MBS-H in 1x Barth's platen. Voor de CMF-MBS borden, giet er 10 ml van de CMF-MBS.
Als de embryo's worden stadium 8,5, start het ontleden van het dier caps in de plaat een 1x Barth's. 10 tot 15 explantaten per monsters zijn meestal genoeg voor een experiment.
Breng het dier dop explantaten naar een CMF-MBS plaat. Incubeer de explantaten voor 45 - 60 minuten tot de explantaten zijn volledig gescheiden. Gentle gemoedsbewegingen in om de 15 minuten zal helpen de dissociatie.

Celadhesie Assay

Zaaien van de cellen: Doseer 500ml 1x MBS-H om de hechting kamer bereid in de stappen in de bovenstaande punten, Adhesie Assay Chambers en Coating de Kamer. Breng de gedissocieerde dier dop cellen van de CMF-MBS plaat om de hechting kamer met behulp van P200 met een sigmacoated en gehakte-off geel tips.
Optioneel: Indien mogelijk, voorzichtig zuigen het medium tot ongeveer 2 / 3 tot de helft, zonder bloot cellen aan de lucht. Voeg ongeveer dezelfde hoeveelheid verse MBS-H, om ervoor te zorgen dat het medium voldoende Ca ^{2 +} bevat en Mg ^{2 +.}
Incubeer bij RT voor 45 - 90 minuten. Kijk dus regelmatig op de cellen te zien of ze zijn verbonden aan de onderkant.
Nu kunt u het beeld van de cellen onder een microscoop.
Zet de hechting kamer op een rooster slide glas. Breng een van de hoeken van de hechting kamer naar een hoek van het raster dia. Tel en noteer het nummer van het bijgevoegde cellen in verschillende netten.
Giet 1L van MBS-H in een grote plastic emmer (bijv. Tupperware, etc.). Voorzichtig de hechting slide kamer te maken aan de bodem van de emmer. Draai het op de orbitale schudder gedurende vijf minuten bij lage snelheid (50 - 60rpm).
Leg de hechting kamer op de grid schuift, het afstemmen van de dezelfde hoek van de kamer naar dezelfde hoek van het raster glijbaan, zoals werd gedaan in stap # 5 van deze sectie, Celadhesie Assay. Tel het aantal cellen die verbonden blijven op hetzelfde rooster die je hebt geteld voordat het wasgoed. Bereken het percentage van cellen die bevestigd blijft na het wassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting