Biology

Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Kişinin kaş yapılan özel bir diseksiyon aracı - Bu video kaş bıçak kullanımı da dahil olmak üzere Xenopus laevis embriyolar, ajanda ve hayvan kutup eksplantlar hazırlanması için kullanılan tekniği göstermektedir. Yapışma tahlil montaj için protokol de önemli adezyon moleküllerinin varlığı için problar yüzey düzenleyen veya uygun şekilde gelişimi için kritik olan hayvan kutup hücreleri mevcut verilir.

Protocol

Yapışma Odaları hazırlanması (bir gün önce enjeksiyon / diseksiyonu)

Yapışma Testi Odaları

Geleneksel bir bileşik mikroskobu (sahne üzerinde optik bulur) varsa, bu düşük bir yükseklikte yapışma odasına aşağıdaki gibi yapmak için ncecessary. Eğer ters-optik mikroskop kullanılarak, daha sonra "Nunc Lab-Tek odacıklı Coverglass" sadece kullanılan ve adımları atlayın # 1 - 2.

40 x 24mm kapak astar üzerine "basın-mühür silikon izolatör" takın. Temiz masa üstü kapak kayma sıkıca yalıtkan basın ve yalıtkan herhangi bir hava kabarcıkları olmadan tamamen takılı olduğundan emin olun diğer taraftan bakın.
İsteğe Bağlı: yapışma odalarına kuru döngüsü Whatman filtre kağıdı ve otoklav ile sterilize etmek için cam Petri kabı koyun. RT serinleyin.

Kaplama Odası

200ml otoklavlanmış bir yapışma odasının merkezi üzerine kaderin (10mg/ml) veya fibronektin (20mg/ml) çözüm çalışma sigmacoated sarı ipuçlarını kullanarak, bir damlacık koyun. 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
Kaderin veya fibronektin çözüm dışarı atın ve bir 1.5ml tüp transfer. Bu çözüm, önümüzdeki iki hafta için yeniden kullanılabilir.
Odanın engellemek için% 4 BSA MBS-H 1x 500ml koyun. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
BSA çözüm aspire. 1x MBS-H 500ml odasına iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, MBS-H (tamamen değil) en aspirat ve 4 º C'de kapalı bir kapta saklayın Bu yapışma odasının sonraki 2 - 3 gün iyidir.

Hayvan kap eksplant Diseksiyon ve ayrılma

Otoklavlanmış 1x MBS-H seyreltilmiş non-otoklavlanmış orta ayrışmış hayvan kap hücreleri rahatsız bazen küçük mikroplar taşır gibi, 0.1x MBS-H enjekte edilen embriyolar, inkübe edin.
60mm yemekleri örneklerin sayısı olarak en azından çok, 1x Barth agaroz plakaları ve CMF-MBS agaroz plakaları olun. 1x Barth plakaları otoklavlanmış 1x MBS-H dökün. CMF-MBS plakalar için, CMF-MBS 10ml dökün.
Embriyoların aşamada 8.5, 1x Barth plaka hayvan kapakları diseksiyon başlar. 10 - numuneler ortalama 15 eksplantlar bir deney için genellikle yeterlidir.
CMF-MBS plaka hayvan kap eksplantlar aktarın. 45 - 60 dakika için eksplantlar eksplantlar tamamen ayrışmış kadar inkübe edin. Nazik ajitasyon her 15 dakikada bir ayrışma yardımcı olacaktır.

Hücre Yapışma Testi

Hücrelerin Yayımlamak: 1x MBS-H 500ml Yukarıdaki bölümlerde, Yapışma Testi Odalar ve Kaplama Odası adımları hazırlanan yapışma odasına koyun. CMF-MBS plaka sigmacoated ve doğranmış-off sarı ipuçları P200 kullanarak yapışma odasına ayrışmış hayvan kap hücreleri aktarın.
İsteğe bağlı: Mümkünse, dikkatle, havaya hücreleri maruz kalmadan, yaklaşık 2 / 3 yarım orta kadar emmek. Yaklaşık olarak aynı ortamda yeterli Ca ² içerdiğinden emin olun miktarda taze MBS-H ⁺ ve Mg ^{2 +.}
45 - 90 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Alt yüzeyinde bağlama olup olmadığını görmek için zaman zaman hücrelerin kontrol edin.
Şimdi hücrelerin mikroskop altında resim alabilir.
Izgara slayt camına yapışma odasına koyun. Yapışma odanın köşelerinden biri ızgara slayt bir köşesine hizalayın. Sayın ve birkaç farklı ızgaraları ekli hücrelerinin sayısını kaydedin.
Büyük bir plastik kova (örneğin, Tupperware, vb.) MBS-H 1L dökün. Yapışma slayt odasına yavaşça kovanın dibine koydu. Az beş dakika boyunca düşük devirli (50) - 60rpm orbital çalkalayıcı döndürün.
Bu bölümde, Hücre Yapışma Testi # 5 adım olarak yapıldı odasının aynı köşede, aynı grid slayt köşesine hizalayarak ızgara slayt geri yapışma odasına koyun. Yıkamadan önce sayılır olduğunu, aynı şebekeye bağlı kalır hücrelerinin sayısını. Yıkamadan sonra bağlı kalır hücrelerinin yüzdesini hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting