Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

Summary

Esta publicación describe cómo utilizar el pescado Agilent Sistema de Identificación de Especies para identificar las especies de peces mediante la extracción de ADN y la realización de PCR y RFLP.

Abstract

Hemos desarrollado una forma rápida, sencilla y precisa de ADN basado en el método de selección para identificar las especies de peces presentes en las muestras de pescados y mariscos frescos y procesados. Este método versátil emplea amplificación por PCR del ADN genómico extraído de muestras de peces, seguidos por los fragmentos de restricción polimorfismo de longitud (RFLP) para generar patrones de fragmentos que se pueden resolver en el Agilent 2100 Bioanalyzer y adaptado a la especie correcta el uso de software RFLP patrones.

El método de identificación de peces utiliza una sencilla y fiable, basada en columnas spin protocolo para aislar el ADN de las muestras de pescado. Las muestras se tratan con proteinasa K para liberar los ácidos nucleicos en solución. ADN se aísla mediante la suspensión de la muestra en tampón de unión y de carga en una taza de giro micro que contienen una matriz de fibra a base de sílice. Los ácidos nucleicos en la muestra se unen a la matriz de fibra. Los ácidos nucleicos inmovilizados se lavan para eliminar los contaminantes, y el ADN total se recupera en un volumen final de 100 microlitros. El ADN aislado está listo para la amplificación por PCR con los primers siempre que se unen a secuencias se encuentran en todos los genomas de los peces. Los productos de PCR se digieren con tres diferentes enzimas de restricción y se resolvieron en el Agilent 2100 Bioanalyzer. La longitudes de los fragmentos producidos en las reacciones de digestión se puede utilizar para determinar las especies de peces de que se preparó la muestra de ADN, usando el patrón de RFLP correspondiente software que contiene una base de datos de forma experimental derivado de los patrones de RFLP de las especies de peces de interés comercial.

Protocol

1: Preparar la muestra de pescado para la extracción de ADN

1. Para cada muestra de peces de la prueba, coloque un pedazo de tejido del pescado, con un peso entre 10 mg y 1 g (crudo o cocido), en un solo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Use la siguiente figura como guía para estimar el peso de una muestra de pescado crudo en función del tamaño de la muestra.
   
   
   Figura 1. Las estimaciones de masa de las muestras de pescado a base de tamaño de la muestra.
   
   
2. Pre-caliente el tampón de digestión de proteinasa K a 65 ° C durante 5 minutos en un baño de agua o incubadora.
3. Prepare una solución de trabajo de la proteinasa K mediante la combinación de 200 l de tampón de digestión con proteinasa K y 20 l de proteinasa K por muestra.
   Nota: Prepare una solución fresca de trabajo de la proteinasa K antes de cada uso.
4. Añadir 220 l de la solución de proteinasa K de trabajo a cada tubo 1,5 ml de muestra de los peces. Incubar los tubos a 65 ° C durante 10 minutos en un baño de agua o incubadora.
5. Girar los tubos en una microcentrífuga durante 3 5 minutos a 14.000 xg para sedimentar los tejidos sin digerir.
6. Transferencia de 150 l de cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml. Evitar la transferencia de cualquier material no digerido en el fondo del tubo o cualquier otro material oleoso que puede estar presente en la parte superior del tubo. Estos tubos de sobrenadante son las muestras de las cuales genómica ADN será extraído.

2: extraer el ADN genómico

1. En un recipiente estéril (tubo de polipropileno o una botella de vidrio), preparar una solución de trabajo para los reguladores ácidos nucleicos y sulfolano unión mediante la combinación de 320 l de 90% sulfolano y 170 l de tampón ácido nucleico vinculante por muestra.
   Usted puede preparar una cantidad suficiente de esta mezcla para procesar tantas muestras como va a examinar, en las próximas 4 semanas. Esta mezcla puede ser almacenado hasta por 30 días a temperatura ambiente. Evite la exposición de la mezcla a la luz durante el almacenamiento.
2. Añadir 490 ul de la mezcla del buffer sulfolano / Encuadernación (preparado en el paso 1) a cada muestra de peces. Vortex o pipeta de la muestra repetidas veces hasta homogeneizar. La adición de esta mezcla un volumen total de cada muestra a 640 microlitros.
3. Transfiera cada muestra de ADN a una Copa del Giro de encuadernación que se ha sentado dentro de un tubo recipiente de 2 ml (incluido) y coloque la tapa del tubo en la parte superior de la copa de vuelta.
4. Girar las muestras en una microcentrífuga durante 1 minuto a 14.000 xg para cargar el ADN en la matriz de taza de giro.
5. Retire y guarde los vasos de giro y desechar los líquidos filtrados. Para cada muestra, cambia el vaso giro en el tubo de recipiente, a continuación, añadir 500 l de 1x tampón lavado de alta de sal y tapar el tubo.
6. Girar las muestras en una microcentrífuga a 14.000 xg durante 1 minuto.
7. Retire y guarde los vasos de giro y desechar los líquidos filtrados. Para cada muestra, cambia el vaso giro en el tubo de recipiente, a continuación, añadir 500 l de etanol al 80% y la tapa del tubo.
8. Girar las muestras en una microcentrífuga a 14.000 xg durante 1 minuto.
9. Repita los pasos 7 y 8 dos veces más para un total de 3 lavados con 500 l de etanol al 80%.
10. Después del tercer lavado en etanol al 80%, eliminar y retener a los vasos de giro y desechar los líquidos filtrados. Vuelva a colocar las copas de giro en los tubos de su receptáculo y girar en una microcentrífuga durante 2 minutos a 14.000 xg para secar la matriz de fibra.
11. Transferencia de las copas de selección para los tubos de recolección de 1,5 m1. Añadir 100 ml de tampón de elución a cada taza de giro directamente en la matriz de la fibra en el interior del vaso. Ajustar las tapas de los tubos de recolección en las copas de giro y se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto.
12. Girar las muestras en una microcentrífuga a máxima velocidad durante 1 minuto.
13. El ADN purificado se encuentra en el tampón de elución en el tubo de microcentrífuga. Deseche el vaso y la tapa girar los tubos. El ADN puede ser almacenado a 4 ° C durante un máximo de un mes. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar el ADN a 20 ° C o 80 ° C.
14. Si lo desea, puede medir la concentración de las muestras de ADN en un espectrofotómetro.

El protocolo de extracción de ADN genómico por lo general los rendimientos de las muestras con una concentración de entre 5 ng / l de 500 ng / l. El protocolo de PCR-RFLP obras pozos con muestras de ADN que van desde 0,05 ng / l hasta 2000 ng / l.

3: Instalación de las reacciones de PCR

1. Prepare un 50 ng / l de dilución del ADN de control positivo mediante la combinación de salmón 8 l de las acciones de ADN con 32 l de agua estéril, libre de DNasa agua. Vortex para mezclar.
   La muestra diluida se puede almacenar a 4 ° C para su uso futuro.
2. Prepare las reacciones mediante la combinación de los componentes en la tabla a continuación en orden. Prepare una mezcla de reactivos única para todas las reacciones de PCR que se llevará a cabo de forma simultánea mediante el incremento de los volúmenes que figuran en elmesa. Además de las muestras de prueba de ADN, son una reacción de control positivo y una reacción de control sin plantilla. Preparación de duplicar las reacciones de PCR para cada muestra de ADN de prueba se recomienda. Preparar la mezcla de los reactivos suficientes para todas sus reacciones, más un exceso de reacción de volumen.
   Por ejemplo, si usted tiene cinco muestras de ADN de pruebas, preparar la mezcla de los reactivos suficientes para cualquiera de las reacciones 8 (5 reacciones de prueba, un control positivo, un no-modelo de control, y el exceso de 1) o 13 si las reacciones son incluidos los duplicados de las reacciones de ensayo (10 reacciones de prueba duplicado, un control positivo, un no-modelo de control y el exceso de 1).
   Mezcla de Reactivo PCR

   Componente	Volumen 1 de reacción	Volumen 5 Reacciones
   dH 2 O, estéril	9 l	45 l
   2x PCR Master Mix	12,5 l	62,5 l
   Primer Mix	2,5 l	12,5 l
   Volumen total	24 l	120 l

3. Vortex la mezcla de reactivo, a continuación, distribuir 24 l de cada individuo de paredes delgadas tubo de reacción de PCR.
4. Añadir 1 l de ADN de control positivo diluido en el tubo de control de la reacción positiva. Para los tubos de ensayo de la muestra, añadir 1 l de muestra de ADN. Para la reacción de control sin plantilla, añadir 1 l de DNasa libre de agua en lugar del ADN.
   Para evitar la contaminación cruzada, use una punta de pipeta nueva para cada muestra de ADN. Después de añadir la muestra, mezclar la reacción rápida de pipeteado del contenido del tubo de arriba y abajo.
5. Tape los tubos de reacción, los tubos vortex para mezclar y centrifugar los tubos brevemente.

4: Ejecutar el protocolo de PCR

1. Lugar las reacciones en el termociclador y ejecute el programa de PCR se muestra a continuación.
   PCR Ciclismo Protocolo

   Segmento	Número de ciclos de	Temperatura	Duración
   1	1	95 ° C	5 minutos
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 segundos 30 segundos 30 segundos
   3	1	72 ° C	7 minutos

5: Recopilación PCR con enzimas de restricción

1. Marque los tubos de 0,5 ml o 0,2 ml tiras de tubos que se van a utilizar para las reacciones de restricción de digerir. Cada reacción de PCR se digirió con tres diferentes enzimas de restricción: DdeI, HaeIII y NlaIII. Por lo tanto, para cada reacción de PCR, etiqueta de tres tubos separados con el nombre de la muestra de PCR y el nombre de la enzima de restricción.
2. Prepare la mezcla de reactivos para las digestiones DdeI mediante la combinación de los siguientes componentes en orden. Prepare una mezcla de reactivos único para todas las reacciones de digestión DdeI (además de por lo menos un exceso de volumen de reacción), utilizando los múltiplos de cada componente. Una vez que el PCR se ha completado, la reacción de PCR son tratados con enzimas de restricción de los fragmentos de restricción polimorfismo de longitud (RFLP).
   La digestión DdeI reactivo Mezcla

   Componente	Volumen
   dH 2 O, estéril	1,5 l
   10x Buffer DdeI	0,5 l
   10x enzima DdeI	0,5 l

3. Vortex la mezcla de reactivo, a continuación, distribuir 2,5 l de los tubos de reacción individuales que fueron etiquetados para DdeI.
4. Prepare la mezcla de reactivos para las digestiones HaeIII mediante la combinación de los siguientes componentes en orden. Prepare una mezcla de reactivos único para todas las reacciones de digestión HaeIII (además de por lo menos un exceso de volumen de reacción), utilizando los múltiplos de cada componente.
   La digestión HaeIII reactivo Mezcla

   Componente	Volumen
   dH 2 O, estéril	1,5 l
   10x Buffer HaeIII	0,5 l
   10x enzima HaeIII	0,5 l

5. Vortex la mezcla de reactivo, a continuación, distribuir 2,5 l de los tubos de reacción individuales que fueron etiquetados para HaeIII.
6. Prepare la mezcla de reactivos para laDigestiones NlaIII mediante la combinación de los siguientes componentes en orden. Prepare una mezcla de reactivos único para todas las reacciones de digestión NlaIII (además de por lo menos un exceso de volumen de reacción), utilizando los múltiplos de cada componente.
   La digestión NlaIII reactivo Mezcla

   Componente	Volumen
   dH 2 O, estéril	1,5 l
   10x Buffer NlaIII	0,5 l
   10x enzima NlaIII	0,5 l

7. Vortex la mezcla de reactivo, a continuación, distribuir 2,5 l de los tubos de reacción individuales que fueron etiquetados para NlaIII.
8. Para cada reacción de digestión, añadir 2,5 l de la correspondiente producto de PCR a los tubos. Todas las reacciones de la prueba PCR, así como la reacción del control positivo deben ser digeridos con las tres enzimas de restricción.
9. Vortex reacciones a la digestión y luego brevemente los tubos de centrifugación.
10. Incubar todas las reacciones de digestión a 37 ° C durante 2 horas. Esta incubación se puede realizar en el termociclador. Si lo desea, las reacciones se pueden dejar a 37 ° C durante la noche.
11. Transferencia de las reacciones a 65 ° C durante 15 minutos. Este paso puede realizarse en el termociclador.
12. Añadir 1 l de 60 mM EDTA (suministrado con el kit) a cada reacción y agitar bien.

6: Analizar los patrones de restricción de digerir

1. Prepare la mezcla de gel colorante, colocar un chip de ADN en la estación de cebado de chips, y la carga de la mezcla en el chip de ADN.
2. Pipeta de 5 l de marcadores de ADN en el bien marcados con el símbolo de la escalera y en cada uno de los 12 pozos de la muestra en el chip.
   Marcadores de ADN se proporciona en el Kit de ADN reactivo 1000 en un tubo verde con tapa.
3. Pipeta de 1 l de escalera del ADN en el bien marcados con un símbolo de la escalera.
   Escalera de ADN se proporciona en el kit de reactivos de ADN 1000 en un tubo de color amarillo con tapa.
4. Para cada una de las muestras de ADN, una pipeta de l de cada reacción de digestión de restricción en uno de los 12 pozos de la muestra en el chip de acuerdo a las directrices en la siguiente figura. Con este enfoque, los pozos de 3.1 son para los tres reacciones de digestión de la muestra de control positivo, los pozos de 4.6 son para el 3 reacciones de digestión de una muestra de prueba, los pozos de 7.9 son para el 3 reacciones de digestión para la muestra de la prueba 2, y los pozos de 10-12 son para los 3 reacciones de digestión de muestra 3.Analyze las reacciones digestión de restricción en el Agilent 2100 Bioanalyzer para determinar las longitudes de los fragmentos producidos durante la digestión. El ADN Agilent 1000 Kit de Guía tiene instrucciones completas para el funcionamiento de los chips de laboratorio en el Bioanalyzer. Un breve protocolo continuación se proporciona para su conveniencia.
   
   
   Figura 2. Organización de las muestras en un chip.
   
   Si usted tiene menos de 4 muestras de ADN, una pipeta de l de agua en los pozos sin usar. Si usted tiene más de 4 muestras de ADN, que tendrá que ejecutar más de un chip. Tenga en cuenta que no es necesario para ejecutar la muestra de control positivo en cada chip.
5. Coloque el chip de forma horizontal en el adaptador de la vórtex IKA y agitar durante 60 segundos a 2400 rpm.
6. Insertar el chip en el Agilent 2100 Bioanalyzer y comenzar el largo chip. Las señales de primas entrantes se muestran en el contexto del instrumento.
   Después de la carrera ha terminado, los picos se identifican en todas las muestras con la configuración del pico encontrar algoritmo. Si usted cree que el algoritmo no ha podido detectar un pico genuino, puede bajar el umbral de altura consigna a un valor que permite que el algoritmo para identificar el pico.
7. Ir al contexto de ensayo y seleccione la pestaña Resumen de Chip. En el campo Nombre de la muestra, introduzca un nombre de ejemplo para los 12 pozos en el chip como se muestra en la siguiente figura.
   
   
   Figura 3. Nombre de entrada de la muestra en la Tabla Resumen de Chip.

7: Identificar las especies de la muestra de prueba utilizando RFLP Matcher

El software de aplicación Agilent RFLP Decoder puede ser utilizado para identificar las especies de peces para las pruebas de ADN sobre la base de la longitudes de los fragmentos producidos en las reacciones de digestión. Tabla 7 esperado tamaños de los fragmentos de ADN en la restricción de control positivo el tamaño del producto enzimático esperada (pb) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 NlaIII 459 Las instrucciones dadas aquí utilizar la configuración por defecto en el análisis de RFLP Matcher. Consulte el sistema de ayuda del software de s para obtener información detallada sobre el funcionamiento del software y la interpretación de la pantalla.

1. El lanzamiento del programa decodificador de RFLP.
2. Haga clic en Archivo> Abrir> Archivo XAD.
   El cuadro de diálogo Abrir Will abierta.
3. Seleccione el archivo XAD para el chip de ADN que incluye las reacciones de digestión de restricción. Haga clic en Abrir.
   Un cuadro de diálogo se abrirá la lista de las muestras que se han cargado en el chip.
4. Seleccione tres reacciones de digestión que corresponde a una muestra de ADN y especifique la enzima de restricción apropiada para cada muestra utilizando el menú desplegable en la columna de la enzima. En la figura siguiente, la columna de la enzima se ha llenado de una muestra de ADN.
   
   
   Figura 4. Especificación de la enzima de restricción para cada muestra.
   
   
5. En el campo denominado altura min pico como% de la menor marcador ", el valor por defecto es de 10.0%. Si es necesario, este valor puede reducirse a identificar los picos pequeños que se perdió, o elevado a descartar picos resultantes de la no-específicas de ruido en el electroferograma. Haga clic en Reintegrar después de hacer los ajustes al valor de pico de altura min.
   
   
   Figura 5. Asignación de la altura del pico mínimo.
   
   
6. Haga clic en Calc en la parte inferior del cuadro de diálogo.
   Los datos de longitud de los fragmentos obtenidos de la ejecución Bioanalyzer que rellenar los campos del software.
7. En la puntuación de la lista desplegable en la esquina superior izquierda de la pantalla, seleccione el algoritmo adecuado para el análisis de los datos. Si la muestra de peces que se analiza consiste en una especie de pez, puede seleccionar Dice (Nei Li) en la puntuación de la lista desplegable. Si las muestras puede consistir en una mezcla de especies, seleccionar la mezcla.
   La tabla en la parte inferior de la pantalla etiquetada puntuación combinada listas de los mejores partidos de las especies sobre la base de los resultados de las tres reacciones de digestión. El nombre de la especie, así como el nombre común se muestran en la tabla (ver abajo). Parejas perfectas (aquellos con una puntuación de 1) se destacan en verde. Partidos en amarillo se consideran cerca de los partidos. Bastará con hacer doble clic en un nombre de la especie para que aparezca la página web de FishBase para esta especie.
   
   
   Figura 6. La identificación de especies, basada en la digestión.
   
   
8. En el corte inferior y hacer coincidir los campos de la tolerancia en la parte superior de la pantalla, puede ajustar la configuración predeterminada para mejorar la puntuación de la mejor combinación de especies. El valor de corte inferior se utiliza para descartar los fragmentos más cortos que la longitud designada en el campo. El valor de tolerancia coincide determina qué tan cerca de la longitud de un fragmento debe ser el fragmento prevé que se considera un partido.
9. Repita los pasos 4 a 8 para el resto de las muestras de ADN que se incluyeron en este mismo chip.

8: Resultados del representante:

Una imagen de un gel Bioanlyzer con muestras de digestión de restricción de cuatro diferentes especies de peces se muestra en la siguiente figura. Los resultados esperados de la muestra de ADN positivos se resumen en la tabla de abajo.


Figura 7. Bioanalyzer gel de imágenes de los restricción reacción de digerir. Cada carril de gel está marcado con la enzima de restricción utilizados en la reacción.

Espera tamaños de fragmentos de ADN en el control positivo de salmón

Figura 8. Espera tamaños de fragmentos de ADN en el control positivo de salmón.

Discussion

Demostramos un simple, rápido y preciso basado en el ADN método de cribado para la identificación de especies de peces en los productos del mar. Este poderoso método ofrece resultados reproducibles y precisos en menos de un día de trabajo y que pueden ser implementadas en las instalaciones de prueba comercial debido a los protocolos simplificados y configuración sencilla. Se caracteriza por la generación de datos objetivos que se analiza mediante RFLP software decodificador con una base de datos ampliable de forma experimental derivada de los perfiles de las especies de peces.

Con la implementación de rutina, este método de prueba tiene el potencial para prevenir mal etiquetado de los productos del mar y ayudar a mantener registros precisos adecuados para el cumplimiento de las regulaciones gubernamentales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various