Basées sur l'ADN des espèces de poissons protocole d'identification

Summary

Cette publication décrit comment utiliser le poisson Espèces d'Agilent Système d'identification d'identifier les espèces de poisson en extrayant de l'ADN et la PCR et effectuer l'analyse RFLP.

Abstract

Nous avons développé une méthode de dépistage rapide, simple et précis basé sur l'ADN pour identifier les espèces de poissons présentes dans les échantillons de fruits de mer frais et transformés. Cette méthode polyvalente emploie amplification par PCR de l'ADN génomique extrait à partir d'échantillons de poisson, suivie par la longueur des fragments de restriction du polymorphisme (RFLP) pour générer des motifs fragment qui peut être résolu sur le bioanalyseur Agilent 2100 et appariés pour l'espèce correcte en utilisant le logiciel correspondant motif de RFLP.

La méthode d'identification des poissons utilise un simple, fiable, spin colonne basée sur le protocole pour isoler l'ADN d'échantillons de poissons. Les échantillons sont traités à la protéinase K pour libérer les acides nucléiques en solution. L'ADN est ensuite isolé par la suspension de l'échantillon dans un tampon de liaison et le chargement sur une tasse de micro-tour contenant une matrice de fibres à base de silice. Les acides nucléiques dans l'échantillon se lient à la matrice de fibres. Les acides nucléiques immobilisés sont lavés pour éliminer les contaminants, et l'ADN total est récupéré dans un volume final de 100 pl. L'ADN isolé est prêt pour l'amplification par PCR avec les amorces fournies qui se lient à des séquences trouvées dans tous les génomes de poisson. Les produits de PCR sont ensuite digéré par trois enzymes de restriction différentes et résolues sur le bioanalyseur Agilent 2100. Les longueurs fragment produits dans les réactions de digestion peuvent être utilisées pour déterminer les espèces de poissons à partir de laquelle l'échantillon d'ADN a été préparé en utilisant le modèle RFLP logiciels de correspondance contenant une base de données des profils RFLP expérimentalement provenant d'espèces de poissons commercialement pertinents.

Protocol

1: préparer les échantillons de poissons d'extraction d'ADN

1. Pour chaque échantillon de poisson à tester, placez un morceau de la chair des poissons, pesant entre 10 mg et 1 g (crus ou cuits), dans un microtube de 1,5 ml à usage unique. Utilisez la figure ci-dessous comme un guide pour estimer le poids d'un échantillon de poisson cru basée sur la taille de l'échantillon.
   
   
   Figure 1. Les estimations de masse des échantillons de poisson basée sur la taille de l'échantillon.
   
   
2. Préchauffer le tampon protéinase K digestion à 65 ° C pendant 5 minutes dans un bain d'incubateur ou de l'eau.
3. Préparer une solution de travail de la protéinase K en combinant 200 pi de tampon de la protéinase K Digestion et 20 pi de la protéinase K par échantillon.
   Note: Préparer une solution fraîche de travail de la protéinase K avant chaque utilisation.
4. Ajouter 220 ul de la solution de protéinase K de travail dans chaque tube de 1,5 ml d'échantillon de poisson. Incuber les tubes à 65 ° C pendant 10 minutes dans un bain d'incubateur ou de l'eau.
5. Faites tourner les tubes dans une microcentrifugeuse pour 3 5 minutes à 14000 xg à granulés tous les tissus non digérés.
6. Transfert 150 pi de chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Eviter de transférer toute matière non digérée par le bas du tube ou tout autre matériau huileux qui peuvent être présents au sommet du tube. Ces tubes de surnageant sont les échantillons dont la génomique l'ADN sera extrait.

2: Extrait d'ADN génomique

1. Dans un récipient stérile (tube en polypropylène ou en bouteille de verre), préparer une solution de travail de tampon acide nucléique sulfolane et reliure en combinant 320 ul de sulfolane 90% et 170 pi de tampon de liaison aux acides nucléiques par échantillon.
   Vous pouvez préparer une quantité suffisante de ce mélange pour traiter autant d'échantillons que vous avez l'intention d'examiner dans les 4 prochaines semaines. Ce mélange peut être conservé jusqu'à 30 jours à température ambiante. Évitez d'exposer le mélange à la lumière pendant le stockage.
2. Ajouter 490 ul du mélange de tampon sulfolane / reliure (préparé à l'étape 1 ci-dessus) à chaque échantillon de poisson. Vortex ou une pipette de l'échantillon jusqu'à ce que homogénéisé. L'ajout de ce mélange porter le volume total de chaque échantillon de 640 pi.
3. Transférer chaque échantillon à une Coupe du Spin liaison à l'ADN qui a été assis dans un tube du réceptacle de 2 ml (fourni) et enclenchez le bouchon du tube sur la partie supérieure de la tasse spin.
4. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse pendant 1 minute à 14000 xg à charger l'ADN sur la matrice de tasse spin.
5. Retirez et conservez les tasses de spin et jetez les filtrats. Pour chaque échantillon, de remplacer la tasse de spin dans le tube du réceptacle, puis ajouter 500 ul de tampon 1x Sel Lavez haute et bouchon du tube.
6. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à 14.000 xg pendant 1 minute.
7. Retirez et conservez les tasses de spin et jetez les filtrats. Pour chaque échantillon, de remplacer la tasse de spin dans le tube du réceptacle, puis ajouter 500 ul d'éthanol à 80% et le bouchon du tube.
8. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à 14.000 xg pendant 1 minute.
9. Répétez les étapes 7 et 8 deux fois plus pour un total de 3 lavages avec 500 pi d'éthanol à 80%.
10. Après le troisième lavage à l'éthanol 80%, enlever et retenir les tasses de spin et jetez les filtrats. Remplacer les tasses de spin dans leurs tubes réceptacle et de spin dans une microcentrifugeuse pendant 2 minutes à 14000 xg pour sécher la matrice de fibres.
11. Transférer la tasse spin pour des tubes de prélèvement de 1,5 m1. Ajouter 100 ul de tampon d'élution à chaque tasse tourner directement sur la matrice de fibres à l'intérieur du gobelet. Aligner les bouchons des tubes de prélèvement sur les tasses de spin et incuber à température ambiante pendant 1 minute.
12. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 1 minute.
13. L'ADN purifié est dans le tampon d'élution dans le microtube. Jeter la tasse spin et bouchon des tubes. L'ADN peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à un mois. Pour stockage à long terme, de stocker l'ADN à 20 ° C ou 80 ° C.
14. Si désiré, vous pouvez mesurer la concentration des échantillons d'ADN dans un spectrophotomètre.

Le protocole d'extraction d'ADN génomique des rendements généralement des échantillons avec une concentration allant de 5 ng / l à 500 ng / ul. Le protocole de PCR-RFLP travaille puits avec des échantillons d'ADN variant entre 0,05 ng / l à 2000 ng / ul.

3: Mettre en place les réactions PCR

1. Préparer un 50 ng / ul de dilution de l'ADN de saumon contrôle positif en combinant 8 ul du stock d'ADN avec 32 ul de solution stérile, DNase eau. Vortex pour mélanger.
   L'échantillon dilué peut être conservé à 4 ° C pour une utilisation future.
2. Préparer les réactions en combinant les composants dans le tableau ci-dessous dans l'ordre. Préparer un mélange réactif unique pour toutes les réactions PCR qui sera exécuté simultanément en intensifiant les volumes répertoriés dans letable. En plus des échantillons de test d'ADN, notamment une réaction de contrôle positif et une réaction de contrôle sans modèle. Préparation reproduire les réactions de PCR pour chaque échantillon d'ADN test est recommandé. Préparer le mélange réactif suffisant pour toutes vos réactions, plus un excès de volume de réaction.
   Par exemple, si vous avez 5 échantillons d'ADN de test, préparer le mélange réactif soit suffisant pour 8 réactions (5 réactions d'essai, 1 contrôle positif, une sans-modèle de contrôle, et 1 en excès) ou 13 réactions si vous êtes y compris les doublons des réactions de test (10 réactions d'essai en double, 1 contrôle positif, une sans-modèle de contrôle et d'une franchise).
   Mélange de réactifs de PCR

   Composante	Volume 1 Réaction	Volume 5 Réactions
   dH 2 O, stérile	9 ul	45 ul
   2x PCR Master Mix	12,5 ul	62,5 ul
   Mélange d'amorces	2,5 pi	12,5 ul
   Le volume total	24 ul	120 pi

3. Vortex du mélange réactif, puis distribuer 24 ul de chaque individu à paroi mince tube de réaction PCR.
4. Ajouter 1 pl de l'ADN contrôle positif dilué dans le tube de réaction de contrôle positif. Pour les tubes d'échantillon de test, ajoutez 1 ul d'échantillon d'ADN d'essai. Pour la réaction de contrôle sans modèle, ajouter 1 l de DNase l'eau à la place de l'ADN.
   Pour éviter la contamination croisée, utiliser une pipette neuf pour chaque échantillon d'ADN. Après l'ajout de l'échantillon, mélanger la réaction rapide de pipetage du contenu du tube de haut en bas.
5. Boucher les tubes de réaction, les tubes vortex pour mélanger et centrifuger les tubes brièvement.

4: Exécuter le protocole de PCR

1. Placez les réactions dans le thermocycleur et lancer le programme PCR-dessous.
   Cyclisme PCR protocole

   Segment	Nombre de cycles	Température	Durée
   1	1	95 ° C	5 minutes
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 secondes 30 secondes 30 secondes
   3	1	72 ° C	7 minutes

5: digérer les produits de PCR avec des enzymes de restriction

1. Etiqueter les tubes de 0,5 ml ou 0,2 ml bandes de tubes qui doivent être utilisés pour les réactions digestion de restriction. Chaque réaction PCR sera digéré par trois enzymes de restriction différentes: Ddel, HaelII et NlalII. Par conséquent, pour chaque réaction PCR, l'étiquette de trois tubes séparés avec le nom de l'échantillon de PCR et le nom de l'enzyme de restriction.
2. Préparer le mélange réactif pour les digestions Ddel en combinant les composants ci-dessous dans l'ordre. Préparez un mélange réactif unique pour toutes les réactions de digestion Ddel (plus au moins un excès de volume de réaction) à l'aide des multiples de chaque composant. Une fois que le PCR est complet, les réactions PCR sont traités avec des enzymes de restriction pour le fragment de restriction polymorphisme (RFLP).
   Mélange réactif Ddel Digestion

   Composante	Volume
   dH 2 O, stérile	1,5 pl
   Tampon 10x Ddel	0,5 ul
   10x enzyme Ddel	0,5 ul

3. Vortex du mélange réactif, puis de distribuer 2,5 pi aux tubes de réaction individuels qui ont été étiquetés pour Ddel.
4. Préparer le mélange réactif pour les digestions HaelII en combinant les composants ci-dessous dans l'ordre. Préparez un mélange réactif unique pour toutes les réactions de digestion HaelII (plus au moins un excès de volume de réaction) à l'aide des multiples de chaque composant.
   Mélange réactif HaelII Digestion

   Composante	Volume
   dH 2 O, stérile	1,5 pl
   Tampon 10x HaelII	0,5 ul
   10x enzymes HaelII	0,5 ul

5. Vortex du mélange réactif, puis de distribuer 2,5 pi aux tubes de réaction individuels qui ont été étiquetés pour HaelII.
6. Préparer le mélange réactif pour laDigestions NlalII en combinant les composants ci-dessous dans l'ordre. Préparez un mélange réactif unique pour toutes les réactions de digestion NlalII (plus au moins un excès de volume de réaction) à l'aide des multiples de chaque composant.
   Mélange réactif NlalII Digestion

   Composante	Volume
   dH 2 O, stérile	1,5 pl
   Tampon 10x NlalII	0,5 ul
   10x enzyme NlalII	0,5 ul

7. Vortex du mélange réactif, puis de distribuer 2,5 pi aux tubes de réaction individuels qui ont été étiquetés pour NlalII.
8. Pour chaque réaction de digestion, ajouter 2,5 ul du produit destiné à la PCR pour les tubes étiquetés. Toutes les réactions PCR test ainsi que la réaction de contrôle positif doivent être digéré par les trois enzymes de restriction.
9. Vortex réactions de la digestion puis centrifuger brièvement les tubes.
10. Incuber toutes les réactions de digestion à 37 ° C pendant 2 heures. Cette incubation peut être réalisée dans le thermocycleur. Si désiré, les réactions peuvent être laissées à 37 ° C pendant la nuit.
11. Transférer les réactions à 65 ° C pendant 15 minutes. Cette étape peut être réalisée dans le thermocycleur.
12. Ajouter 1 ul de 60 mM d'EDTA (fourni avec le kit) pour chaque réaction et le vortex ainsi.

6: Analyser les profils de restriction digest

1. Préparer le mélange gel-dye, placer une puce à ADN sur la station d'amorçage à puce, et de charger le mélange sur la puce à ADN.
2. Pipeter 5 ul de marqueur d'ADN dans le bien marqué avec le symbole échelle et dans chacun des 12 puits d'échantillon sur la puce.
   Marqueur d'ADN est fourni dans le kit de réactifs DNA 1000 dans un tube vert plafonné.
3. Pipeter 1 pl de l'échelle d'ADN dans le bien marquée avec un symbole échelle.
   Échelle d'ADN est fourni dans le kit ADN Réactif 1000 dans un tube jaune-plafonnées.
4. Pour chacun des échantillons d'ADN, pipette 1 pl de chaque réaction digestion de restriction dans l'un des 12 puits d'échantillon sur la puce selon les directives dans la figure ci-dessous. En utilisant cette approche, 1-3 puits sont pour les 3 réactions de digestion de l'échantillon de contrôle positif, puits 4-6 sont pour les 3 réactions de digestion pour 1 échantillon de test, des puits 7-9 sont pour les 3 réactions de digestion pour deux échantillon de test, et des puits 10-12 sont pour les 3 réactions de digestion pour l'échantillon d'essai 3.Analyze réactions digestion de restriction sur le bioanalyseur Agilent 2100 pour déterminer les longueurs de fragments produits pendant la digestion. L'ADN d'Agilent 1000 Kit Guide contient des instructions complètes pour l'exécution du laboratoire de puces sur le bioanalyseur. Un bref protocole est fournie ci-dessous pour votre commodité.
   
   
   Figure 2. Organisation des échantillons sur puce.
   
   Si vous avez moins de 4 échantillons d'ADN, pipette 1 pl de l'eau dans les puits inutilisés. Si vous avez plus de 4 échantillons d'ADN, vous aurez besoin d'exécuter plus d'une puce. Notez qu'il n'est pas nécessaire d'exécuter l'échantillon de contrôle positif sur chaque puce.
5. Placer la puce à l'horizontale dans l'adaptateur de l'IKA vortex et le vortex pendant 60 secondes à 2400 rpm.
6. Insérez la puce dans le bioanalyseur Agilent 2100 et commencer la course à puce. Les signaux entrants premières sont affichées dans le contexte de l'instrument.
   Après la course est terminée, les pics sont identifiés pour tous les échantillons en utilisant les réglages du pic de trouver des algorithmes. Si vous croyez que l'algorithme n'a pas réussi à détecter un véritable sommet, vous pouvez abaisser le seuil de hauteur de consigne à une valeur qui permet à l'algorithme pour identifier le pic.
7. Aller au contexte Assay et sélectionnez l'onglet Résumé Chip. Dans le champ Nom de l'échantillon, entrez un nom d'échantillon pour l'ensemble des 12 puits sur la puce, comme indiqué dans la figure ci-dessous.
   
   
   Figure 3. Entrée Nom de l'échantillon dans l'onglet Résumé Chip.

7: Identifier les espèces de l'échantillon de test en utilisant RFLP Matcher

Le logiciel d'application Agilent RFLP décodeur peut être utilisé pour identifier les espèces de poissons pour les échantillons d'ADN test basé sur les longueurs fragment produits dans les réactions de digestion. Tableau 7 Tailles attendus fragment d'ADN dans la restriction de contrôle Taille Positive produit enzymatique attendus (pb) Ddel 117 , 332, 340 HaelII 40, 105, 333, 459 NlalII Les instructions fournies ici d'utiliser les paramètres par défaut dans l'analyse RFLP Matcher. Reportez-vous au système d'aide du logiciel pour des informations détaillées sur le fonctionnement du logiciel et l'interprétation de l'affichage.

1. Lancez le programme décodeur RFLP.
2. Cliquez sur Fichier> Ouvrir> Fichier XAD.
   La boîte de dialogue Ouvrir wilL ouvert.
3. Sélectionnez le fichier XAD pour la puce à ADN qui comprenait les réactions digestion de restriction. Cliquez sur Ouvrir.
   Une boîte de dialogue s'ouvre listant les échantillons qui ont été chargés sur la puce.
4. Sélectionnez trois réactions de digestion correspondant à un échantillon d'ADN et de spécifier l'enzyme de restriction appropriée pour chaque échantillon en utilisant le menu déroulant sous la colonne de l'enzyme. Dans la figure ci-dessous, la colonne de l'enzyme a été rempli pour l'échantillon d'ADN 1.
   
   
   Figure 4. Spécification enzyme de restriction pour chaque échantillon.
   
   
5. Dans le champ intitulé hauteur de pic min en% de la baisse des marqueurs ", la valeur par défaut est de 10,0%. Si nécessaire, cette valeur peut être abaissée à identifier les petits pics qui a été manquée, ou porté à jeter des pics résultant du non-spécifiques du bruit dans le électrophérogramme. Cliquez Réintégrer après avoir fait les ajustements à la valeur de la hauteur du pic min.
   
   
   Figure 5. Attribution hauteur de pic minimum.
   
   
6. Cliquez Calc au bas de la boîte de dialogue.
   Les données de longueur des fragments obtenus à partir de la course sera Bioanalyzer remplir les champs du logiciel.
7. Dans la partition de la liste déroulante dans le coin supérieur gauche de l'écran, sélectionnez l'algorithme approprié pour l'analyse des données. Si l'échantillon de poissons en cours d'analyse se compose d'un seule espèce de poisson, sélectionnez Dice (Nei Li) dans le score dans la liste déroulante. Si les échantillons peuvent être constitués d'un mélange d'espèces, sélectionnez Mélange.
   Le tableau au bas de l'écran étiquetés score combiné listes des meilleures espèces correspondant sur ​​la base des résultats des trois réactions de digestion. Le nom de l'espèce ainsi que le nom commun sont énumérés dans le tableau (voir ci-dessous). Accords parfaits (ceux avec un score de 1) sont surlignés en vert. Matchs surlignés en jaune sont considérés comme proches des allumettes. Vous pouvez double-cliquer sur un nom d'espèce pour faire apparaître la page web de FishBase pour cette espèce.
   
   
   Figure 6. Identification des espèces basée sur la digestion.
   
   
8. Dans la partie inférieure de coupure et les champs de tolérance match au sommet de l'écran, vous pouvez ajuster les paramètres par défaut afin d'améliorer le score de la meilleure correspondance espèces. La valeur de coupure inférieure est utilisée pour rejeter tous les fragments de plus courte que la longueur désignée dans le domaine. La valeur de tolérance correspond détermine la distance en longueur d'un fragment doit être au fragment prévu pour être considéré comme une correspondance.
9. Répétez les étapes 4 à 8 pour les échantillons d'ADN restants qui ont été inclus sur cette même puce.

8: Résultats du représentant:

Une image d'un gel Bioanlyzer avec des échantillons de digestion de restriction de 4 différentes espèces de poissons est montré dans la figure ci-dessous. Les résultats attendus pour l'échantillon d'ADN positifs sont résumées dans le tableau ci-dessous.


Figure 7. Bioanalyzer gel de l'image d'échantillons restriction de la réaction digérer. Chaque ruelle gel est étiqueté avec l'enzyme de restriction utilisés dans cette réaction.

Tailles attendus fragment d'ADN dans le contrôle positif de saumon

Figure 8. Tailles attendus fragment d'ADN dans le contrôle positif de saumon.

Discussion

Nous démontrons une méthode de dépistage simple, rapide et précis à base d'ADN pour l'identification des espèces de poissons dans des produits marins. Cette méthode puissante fournit reproductibles, des résultats précis en moins d'une journée de travail et il peut être mis en œuvre dans les installations d'essais commerciaux en raison de protocoles rationalisée et une configuration simple. Elle est caractérisée par la production de données objectives qui est analysée par RFLP décodeur logiciel avec une base de données extensible de façon expérimentale dérivée des profils des espèces de poissons.

Avec la mise en œuvre de routine, cette méthode d'essai a le potentiel de prévenir mauvais étiquetage des produits de la mer et les aider à maintenir des dossiers précis adapté à la conformité aux réglementations gouvernementales.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various