Baseados em DNA Peixe Protocolo Identificação de Espécies

Summary

Esta publicação descreve como usar o Peixe Agilent Sistema de Identificação de Espécies para identificar as espécies de peixe através da extração de DNA e realização de PCR e análise de RFLP.

Abstract

Nós desenvolvemos um método de triagem rápida, simples e precisas baseadas em DNA para identificar as espécies de peixes presentes em amostras de frutos do mar frescos e processados. Este método emprega versátil amplificação do DNA genômico extraído de amostras de peixe, seguido de restrição de comprimento análise de polimorfismo de fragmento (RFLP) para gerar padrões de fragmentos que podem ser resolvidos no Agilent 2100 Bioanalyzer e combinados para a espécie correta usando RFLP software padrão de correspondência.

O método de identificação de peixes utiliza uma simples, confiável, spin protocolo baseado em colunas para isolar o DNA de amostras de peixe. As amostras são tratadas com proteinase K para liberar os ácidos nucléicos na solução. DNA é então isolado pela suspensão da amostra em tampão de ligação e carregamento para uma xícara de giro de micro-fibra contendo uma matriz à base de sílica. Os ácidos nucléicos na amostra se ligam à matriz de fibra. Os ácidos nucléicos imobilizados são lavadas para remover contaminantes, e DNA total é recuperado em um volume final de 100 ul. O DNA isolado está pronto para a amplificação com os primers, desde que se ligam a seqüências encontradas em todos os genomas de peixe. Os produtos de PCR são então digeridos com três enzimas de restrição diferente e deliberou sobre a Agilent 2100 Bioanalyzer. Os comprimentos fragmento produzido nas reações de digestão pode ser usado para determinar as espécies de peixes a partir do qual a amostra de DNA foi preparado, usando o padrão RFLP combinando software contendo um banco de dados de padrões de RFLP experimentalmente derivados de espécies de peixes comercialmente importantes.

Protocol

1: Prepare a amostras de pescado para Extração de DNA

1. Para cada amostra de peixe a ser testada, coloque um pedaço de tecido de peixes, pesando entre 10 mg e 1 g (crus ou cozidos), em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Use a figura abaixo como uma diretriz para estimar o peso de uma amostra de peixe cru com base no tamanho da amostra.
   
   
   Figura 1. As estimativas de massa das amostras de peixe com base no tamanho da amostra.
   
   
2. Pré-aquecer o tampão de digestão proteinase K a 65 ° C por 5 minutos em um banho de incubadora ou água.
3. Prepare uma solução de trabalho de Proteinase K, combinando 200 mL de Proteinase K e tampão de digestão 20 l de proteinase K por amostra.
   Nota: Prepare uma nova solução de trabalho de Proteinase K antes de cada utilização.
4. Adicionar 220 mL da solução de proteinase K em cada tubo 1,5 mL de amostra de peixe. Incubar os tubos a 65 ° C por 10 minutos em um banho de incubadora ou água.
5. Girar os tubos em microcentrífuga por 3 5 minutos a 14.000 xg para pellet quaisquer tecidos não digerido.
6. Transferência de 150 mL de cada sobrenadante para um tubo de 1,5 ml doce. Evitar a transferência de qualquer material não digerido no fundo do tubo ou qualquer material oleoso que pode estar presente no topo do tubo. Esses tubos são do sobrenadante das amostras a partir do qual genômica DNA será extraído.

2: Extrair DNA genômico

1. Em um recipiente estéril (tubo de polipropileno ou garrafa de vidro), prepare uma solução de trabalho de tampão de ácido nucléico e sulfolane Binding combinando 320 mL de sulfolane 90% e 170 mL de Tampão Ácido Nucleico Binding por amostra.
   Você pode querer preparar uma quantidade suficiente da mistura para processar amostras como muitos como você pretende examinar nos próximos quatro semanas. Essa mistura pode ser armazenado por até 30 dias em temperatura ambiente. Evite expor a mistura à luz durante o armazenamento.
2. Adicionar 490 mL da mistura de buffer sulfolane / Binding (preparada no passo 1 acima) a cada amostra de peixe. Vortex ou pipeta na amostra repetidamente até homogeneizado. A adição dessa mistura trará o volume total de cada amostra para 640 mL.
3. Transferir cada amostra para uma Copa do spin DNA Binding que foi sentado dentro de um tubo de receptáculo de 2 ml (fornecido) e encaixe a tampa do tubo para o topo do copo spin.
4. Girar as amostras em microcentrífuga por 1 minuto a 14.000 xg para carregar o DNA sobre a matriz copo spin.
5. Remova e guarde os copos de spin e descartar os filtrados. Para cada amostra, substitua o copo girar no tubo de recipiente, em seguida, adicione 500 mL de tampão 1x alta Sal Lavar e tampa do tubo.
6. Girar as amostras em uma microcentrífuga a 14.000 xg por 1 minuto.
7. Remova e guarde os copos de spin e descartar os filtrados. Para cada amostra, substitua o copo girar no tubo de recipiente, em seguida, adicione 500 mL de etanol 80% e tampa do tubo.
8. Girar as amostras em uma microcentrífuga a 14.000 xg por 1 minuto.
9. Repita as etapas 7 e 8 mais duas vezes para um total de 3 lavagens com 500 mL de etanol 80%.
10. Após a terceira lavagem em etanol 80%, remover e reter os copos de spin e descartar os filtrados. Substituir os copos de spin em tubos de seu receptáculo e girar em microcentrífuga por 2 minutos a 14.000 xg para secar a matriz de fibra.
11. Transferir os copos de giro para tubos de 1,5 m1 coleção. Adicionar 100 l de tampão de eluição para cada xícara de spin diretamente sobre a matriz de fibra dentro do copo. Encaixe as tampas dos tubos de coleta para os copos de spin e incubar à temperatura ambiente por 1 minuto.
12. Girar as amostras em uma microcentrífuga a velocidade máxima durante 1 minuto.
13. O DNA purificado é no tampão de eluição no tubo de microcentrífuga. Descartar o copo girar e tampa dos tubos. O DNA pode ser armazenado a 4 ° C por até um mês. Para armazenamento a longo prazo, armazenar o DNA a 20 ° C ou 80 ° C.
14. Se desejar, você pode medir a concentração das amostras de DNA em espectrofotômetro.

O protocolo de extração de DNA genômico normalmente produz amostras com uma concentração variando de 5 ng / mL a 500 ng / mL. O protocolo de PCR-RFLP poços funciona com amostras de DNA que variam de 0,05 ng / mL a 2000 ng / mL.

3: Configurar as reações de PCR

1. Prepare uma diluição 50 ng / mL do DNA controle positivo salmão, combinando 8 mL do estoque de DNA com 32 mL de estéreis, a água livre de DNase. Vortex para misturar.
   A amostra diluída pode ser armazenado a 4 ° C para uso futuro.
2. Prepare as reações através da combinação dos componentes na tabela abaixo em ordem. Prepare uma mistura de reagentes único para todas as reações de PCR que será executado simultaneamente por ampliação dos volumes listados namesa. Além do teste de amostras de DNA, inclua um controle positivo de reação e uma reação sem controle de template. Preparando reações duplicar PCR para cada amostra de DNA teste é recomendado. Prepare a mistura reagente suficiente para todas as suas reações mais um excesso de volume de reação.
   Por exemplo, se você tem 5 amostras de DNA de teste, prepare a mistura reagente suficiente para 8 ou reações (5 reações de teste, um controle positivo, um controle de nenhum modelo, e um excesso) ou 13 reações se você está incluindo duplicatas das reações teste (10 reações testes em duplicado, um controle positivo, um controle de nenhum modelo e um excesso).
   PCR Mistura Reagente

   Componente	Volume 1 Reação	Volume 5 Reações
   dH 2 O estéril	9 mL	45 mL
   2x PCR Master Mix	12,5 mL	62,5 mL
   Mix Primer	2,5 mL	12,5 mL
   Volume total	24 mL	120 mL

3. Vortex da mistura de reagentes bem, em seguida, distribuir 24 mL para cada indivíduo tubo de reação de paredes finas PCR.
4. Adicionar 1 ml do DNA controle positivo diluído ao tubo controle positivo da reação. Para os tubos de amostra, adicionar 1 ml de amostra de DNA de teste. Para a reação sem controle de template, adicione 1 ml de água livre de DNase no lugar do DNA.
   Para evitar a contaminação cruzada, use uma ponta de pipeta nova para cada amostra de DNA. Após adicionar a amostra, misturar a reação rápida pipetagem do conteúdo do tubo de cima e para baixo.
5. Cap os tubos de reação, os tubos de vórtice para misturar e centrifugar os tubos brevemente.

4: Execute o Protocolo de PCR

1. Coloque as reações no termociclador e executar o programa de PCR mostrado abaixo.
   PCR Ciclismo Protocolo

   Segmento	Número de ciclos	Temperatura	Duração
   1	1	95 ° C	5 minutos
   2	40	95 ° C 50 ° C 72 ° C	30 segundo 30 segundo 30 segundo
   3	1	72 ° C	7 minutos

5: Digest produtos PCR com enzimas de restrição

1. Identifique os tubos de 0,5 ml ou 0,2 ml tubos faixa que estão a ser utilizados para as reações de restrição digerir. Cada reação de PCR serão digeridos com três enzimas de restrição diferente: DdeI, HaeIII e NlaIII. Portanto, para cada reação de PCR, rótulo três tubos separados com o nome da amostra PCR eo nome da enzima de restrição.
2. Prepare a mistura de reagentes para a digestão DdeI combinando os componentes abaixo na ordem. Prepare uma mistura de reagentes único para todas as reações de digestão DdeI (e pelo menos um excesso de volume de reação), utilizando múltiplos de cada componente. Uma vez que a PCR é concluída, as reações de PCR são tratados com enzimas de restrição para a restrição de comprimento análise de polimorfismo de fragmento (RFLP).
   DdeI Mistura Reagente Digestão

   Componente	Volume
   dH 2 O estéril	1,5 mL
   Tampão DdeI 10x	0,5 mL
   Enzima DdeI 10x	0,5 mL

3. Vortex da mistura de reagentes bem, então distribuir 2,5 mL para os tubos de reação individual que foram rotulados de DdeI.
4. Prepare a mistura de reagentes para a digestão HaeIII, combinando os componentes abaixo na ordem. Prepare uma mistura de reagentes único para todas as reações de digestão HaeIII (e pelo menos um excesso de volume de reação), utilizando múltiplos de cada componente.
   HaeIII Mistura Reagente Digestão

   Componente	Volume
   dH 2 O estéril	1,5 mL
   Tampão HaeIII 10x	0,5 mL
   Enzima HaeIII 10x	0,5 mL

5. Vortex da mistura de reagentes bem, então distribuir 2,5 mL para os tubos de reação individual que foram rotulados de HaeIII.
6. Prepare a mistura de reagentes para oDigestões NlaIII combinando os componentes abaixo na ordem. Prepare uma mistura de reagentes único para todas as reações de digestão NlaIII (e pelo menos um excesso de volume de reação), utilizando múltiplos de cada componente.
   NlaIII Mistura Reagente Digestão

   Componente	Volume
   dH 2 O estéril	1,5 mL
   Tampão NlaIII 10x	0,5 mL
   Enzima NlaIII 10x	0,5 mL

7. Vortex da mistura de reagentes bem, então distribuir 2,5 mL para os tubos de reação individual que foram rotulados de NlaIII.
8. Para cada reação de digestão, adicionar 2,5 mL do produto da PCR apropriado para os tubos rotulados. Todas as reações do teste de PCR, bem como o controle de reação positiva precisam ser digeridos com três enzimas de restrição.
9. Reações Vortex a digestão e, em seguida, uma breve centrifugação dos tubos.
10. Incubar todas as reações de digestão a 37 ° C por 2 horas. Esta incubação pode ser realizada no termociclador. Se desejar, reações podem ser deixadas a 37 ° C durante a noite.
11. Transferir as reações a 65 ° C por 15 minutos. Esta etapa pode ser realizada no termociclador.
12. Adicionar 1 ml de 60 mM EDTA (fornecido com o kit) para cada reação e vortex bem.

6: Analisar os padrões de restrição digest

1. Prepare a mistura de gel-dye, coloque um chip de DNA na estação de priming chip, e carregar o mix para o chip de DNA.
2. Pipete 5 de marcador de DNA para o bem marcado com o símbolo da escada e em cada um dos 12 poços de amostra sobre o chip.
   Marcador de DNA é fornecido no kit de reagentes DNA 1000 em um tubo verde-capped.
3. Pipete 1 de escada de DNA para o bem marcado com um símbolo de escada.
   Escada de DNA é fornecido no kit de reagentes DNA 1000 em um tubo amarelo-capped.
4. Para cada uma das amostras de DNA, Pipete 1 de cada reação digerir restrição em um dos 12 poços de amostra no chip de acordo com as orientações na figura abaixo. Usando essa abordagem, poços 1-3 são para as 3 reações de digestão para a amostra de controlo positivo, poços 4-6 são para os três reações de digestão de amostra 1, 7-9 poços são para os três reações de digestão de amostra de teste 2, 12/10 e poços são para os três reações digestão para amostra 3.Analyze as reações restrição digerir a Agilent 2100 Bioanalyzer para determinar os comprimentos fragmento produzido durante a digestão. A Agilent DNA 1000 Kit Guia tem instruções completas para executar as fichas de laboratório sobre o Bioanalyzer. Um protocolo breve é ​​fornecido abaixo para sua conveniência.
   
   
   Figura 2. Organização das amostras no Chip.
   
   Se você tem menos de 4 amostras de DNA, Pipete 1 de água nos poços não utilizados. Se você tiver mais de quatro amostras de DNA, você terá de executar mais de um chip. Note que não é necessário para executar o amostra de controlo positivo em cada chip.
5. Colocar o chip no adaptador horizontal do misturador vórtice IKA e vortex por 60 segundos a 2400 rpm.
6. Inserir o chip no 2100 Agilent Bioanalyzer e iniciar a execução chip. Os sinais de entrada-primas são exibidas no contexto Instrumento.
   Após a corrida tenha terminado, os picos são identificados para todas as amostras usando as configurações do pico encontrar algoritmo. Se você acredita que o algoritmo falhou em detectar um pico genuíno, você pode reduzir o setpoint Threshold Altura para um valor que permite que o algoritmo para identificar o pico.
7. Ir para o contexto de análise e selecione a aba Resumo Chip. No campo Nome da Amostra, digite um nome de exemplo para todos os 12 poços no chip, como mostrado na figura abaixo.
   
   
   Figura 3. Amostra Entrada Nome em Tab Resumo Chip.

7: Identificar a espécie de teste de amostra usando RFLP Matcher

A Agilent software aplicativo RFLP Decoder pode ser usado para identificar as espécies de peixes para as amostras de teste de DNA com base no comprimento do fragmento produzido nas reações de digestão. Tabela 7 Tamanhos DNA Fragment esperado no controle positivo Enzima de Restrição Tamanho do produto esperado (bp) DdeI 117 , 332, 340 HaeIII 40, 105, 333 459 NlaIII As instruções fornecidas aqui usar as configurações padrão na análise de RFLP Matcher. Referem-se ao sistema de software s ajuda para obter informações detalhadas sobre a operação do software e interpretar a mostrar.

1. O lançamento do programa Decoder RFLP.
2. Clique em Arquivo File> Open> XAD.
   O wil caixa de diálogo Abrirl aberto.
3. Selecione o arquivo XAD para o chip de DNA, que incluiu as reações digerir restrição. Clique em Abrir.
   Uma caixa de diálogo se abrirá, listando as amostras que foram carregados no chip.
4. Selecione três reações de digestão correspondendo a uma amostra de DNA e especificar a enzima de restrição apropriada para cada amostra usando o drop-down menus na coluna enzimática. Na figura abaixo, a coluna de enzimas tem sido preenchido para o DNA da amostra 1.
   
   
   Figura 4. Especificando de restrição enzimática para cada amostra.
   
   
5. No campo min altura do pico em% do menor marcador ", o valor padrão é de 10,0%. Se necessário, este valor pode ser reduzido para identificar pequenos picos que foi perdido, ou levantou para descartar picos resultantes da não-específico de ruído na electroferograma. Clique Reintegrate depois de fazer os ajustes ao valor de pico min altura.
   
   
   Figura 5. Atribuindo altura máxima mínima.
   
   
6. Clique Calc na parte inferior da caixa de diálogo.
   Os dados comprimento de fragmentos obtidos a partir da execução Bioanalyzer vai preencher os campos software.
7. No escore de lista suspensa no canto superior esquerdo da tela, selecione o algoritmo apropriado para a análise dos dados. Se a amostra de peixe em análise consiste em uma espécie de peixe única, selecione Dice (Nei Li) na pontuação drop-down list. Se as amostras podem consistir de uma mistura de espécies, selecione Mistura.
   A tabela na parte inferior da tela rotulada pontuação combinada lista as melhores espécies partidas com base nos resultados de todas as três reações de digestão. O nome da espécie, bem como o nome comum estão listados na tabela (veja abaixo). Fósforos perfeitos (aqueles com uma pontuação de 1) são destacadas em verde. Jogos em amarelo são consideradas próximas partidas. Você pode clicar duas vezes no nome de uma espécie para abrir a página FishBase para esta espécie.
   
   
   Figura 6. Identificação de espécies Baseado em digestão.
   
   
8. Na parte inferior de corte e campos corresponder tolerância no topo da tela, você pode ajustar as configurações padrão para melhorar a pontuação do jogo melhor espécie. O valor de corte inferior é usada para descartar quaisquer fragmentos mais curtos que o comprimento designado no campo. Coincidir com o valor de tolerância determina o quão perto de comprimento deve ser um fragmento do fragmento previsto para ser considerado uma correspondência.
9. Repita os passos 4 a 8 para as amostras de DNA restantes que foram incluídos neste mesmo chip.

8: Resultados Representante:

Uma imagem de um gel Bioanlyzer com amostras restrição digerir a partir de 4 diferentes espécies de peixes é mostrada na figura abaixo. Os resultados esperados para a amostra de DNA positivos são resumidos na tabela abaixo.


Figura 7. Bioanalyzer imagem gel de amostras restrição reação digerir. Cada lane gel é marcado com a enzima de restrição utilizada nessa reação.

Tamanhos de DNA esperado Fragment no controle Salmon positivo

Figura 8. Tamanhos de DNA esperado Fragment no controle Salmon Positivo.

Discussion

Demonstramos um método de triagem simples, rápido e preciso baseados em DNA para a identificação de espécies de peixes em produtos do mar. Este poderoso método fornece reprodutível, resultados precisos em menos de um dia útil e pode ser implementada em instalações de teste comercial, devido aos protocolos simples e de configuração simples. Caracteriza-se pela geração de dados objetivos, que é analisada utilizando RFLP software decodificador com um banco de dados de perfis de espécies expansível experimentalmente derivados de peixe.

Com a implementação de rotina, este método de teste tem o potencial para evitar tachar de produtos do mar e auxiliar na manutenção de registros exatos adequado para cumprimento de regulamentações governamentais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various