Summary
MSH2-MSH6 é responsável por iniciar reparação de erros de replicação de DNA. Aqui nós apresentamos uma abordagem cinética transitória para a compreensão crítica como esta proteína funciona. O relatório ilustra stopped-flow experimentos para medir a ligação DNA acopladas e cinética ATPase subjacente MSH2-MSH6 mecanismo de ação no reparo do DNA.
Abstract
Análise cinética transitória é indispensável para a compreensão do funcionamento de macromoléculas biológicas, uma vez que esta abordagem produz informações mecanicista incluindo concentrações sítio ativo e constantes de velocidade intrínseca que governam a função de macromoléculas. Em caso de enzimas, por exemplo, medições estado transiente ou pré-estável identificar e caracterizar os eventos individuais no caminho da reação, enquanto que as medições estado estacionário só o rendimento global de eficiência catalítica e especificidade. Eventos individuais, como a proteína-proteína ou proteína-ligante interações e limitação de taxa de mudanças conformacionais ocorrem frequentemente na escala de tempo de milissegundos, e pode ser medido diretamente pelo stopped-flow e químico-quench métodos de fluxo. Dado um sinal óptico, tais como fluorescência, stopped-flow serve como uma ferramenta poderosa e acessível para monitorar o progresso reação de substrato de ligação para lançamento do produto e volume de negócios 1,2 catalítico.
Aqui, relatamos a aplicação de stopped-flow cinética para investigar o mecanismo de ação de MSH2-MSH6, uma proteína de reparo do DNA eucariótico que reconhece pares de bases das disparidades e de inserção / deleção no DNA loops e reparar os sinais de incompatibilidade (MMR) 3-5. Ao fazer isso, MSH2-MSH6 aumenta a precisão da replicação do DNA por três ordens de magnitude (freqüência de erro diminui de ~ 10 -6 a 10 -9 bases), e assim ajuda a preservar a integridade genômica. Não surpreendentemente, com defeito função MSH2-MSH6 humano é associado com câncer de cólon hereditário não-polipose e outros cânceres esporádicos 6-8. A fim de compreender o mecanismo de ação dessa proteína metabólica crítica DNA, estamos investigando a dinâmica de MSH2-MSH6 interação com DNA incompatíveis, bem como a atividade de ATPase que alimenta suas ações no MMR. DNA de ligação é medida pela rápida mistura MSH2-MSH6 com DNA contendo a 2 aminopurina-(2-Ap) adjacente a um fluoróforo G: T incompatibilidade e acompanhamento do aumento resultante em 2 aminopurina-fluorescência em tempo real. DNA dissociação é medido através da mistura pré-formada MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complexo incompatibilidade com o DNA armadilha sem rótulo e diminuir monitoramento de fluorescência ao longo do tempo 9. Pré-ATPase constante cinética de estado são medidos pela mudança de fluorescência de 7-dietilamino-3-((((2-maleimidyl) etil) amino) carbonil) cumarina) marcado Protein Fosfato Binding (MDCC-PBP) em fosfato de ligação ( Pi) liberado pela MSH2-MSH6 seguintes ATP hidrólise 9,10.
Os dados revelam ligação rápida de MSH2-MSH6 para um G: Incompatibilidade de T e formação de uma vida longa MSH2-MSH6 G: T complexo, que resulta na supressão da ATP hidrólise e estabilização da proteína em um formulário de ATP-bound . A cinética da reação assegurar um apoio claro para a hipótese de que o ATP-bound MSH2-MSH6 sinais de reparo de DNA em ligação de um par de bases desiguais em dupla hélice.
F. Noah Biro e Jie Zhai contribuíram para este trabalho de forma igual.
Protocol
A. Medição de MSH2-MSH6 DNA Cinética Binding
1. Preparação de amostras para o ensaio de cinética de MSH2-MSH6 DNA de ligação
Preparação de reagentes para uma experiência de DNA por fluorescência baseada cinética de ligação em uma parada de fluxo é semelhante ao de um experimento de equilíbrio em um fluorímetro. Na verdade análise de equilíbrio de ligação deve ser feita primeiro para calcular a constante de dissociação (K D) para a interação, a fim de otimizar as condições de reação para análise cinética. Stopped-flow experimentos requerem grandes quantidades de materiais biológicos em comparação com experimentos de equilíbrio ou steady-state e, portanto, a abordagem é mais viável quando baixo quantidades de miligramas de proteína estão disponíveis 11,12 e quantidades similares de ligantes podem ser preparados ou comprados.
- Nós sobre-expressar S. cerevisiae MSH2-MSH6 em E. coli e purificar quantidades miligramas da proteína por cromatografia de troca iônica (Fig. 1) 11.
- Reagentes DNA com ou sem o fluoróforo 2-aminopurina pode ser quimicamente sintetizada. Nós compramos 37 nucleotídeos de comprimento single-stranded DNA modificado com 2-aminopurina e anneal duas vertentes complementares para preparar DNA duplex com 2-aminopurina adjacente a um G: T incompatibilidade (Fig. 2). DNA pode ser purificado pelo fabricante ou em laboratório por eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, este último geralmente dá rendimentos mais elevados.
- Para a cinética de ligação ao DNA, prepare G separados: T (2-Ap) e amostras de DNA MSH2-MSH6 proteína em tampão DNA binding (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM MgCl 2, 100 mM NaCl). MSH2-MSH6 e as concentrações de DNA são 0,8 mM e 0,12 mM, respectivamente, que rende 0,4 mM e 0,06 mM concentrações finais em um único experimento com mistura 1:1 de mistura. DNA de dissociação cinética, preparar uma amostra contendo 0,8 mM MSH2-MSH6 e 0,12 mM G: T (2-Ap) DNA, e outra amostra com 8 mM unlabeled G: T DNA como uma armadilha para livre-MSH2 MSH6. Preparar e armazenar as amostras em gelo. Nestas reações, a concentração de proteína é bem acima do 10 nM K D para MSH2-MSH6 DNA-DNA interação e concentração é suficiente para um sinal robusto de fluorescência (determinada empiricamente). Um volume de 400 mL por amostra é suficiente para obter cerca de 10 traços cinética (Tabela 1).
- Usar produtos químicos de alta qualidade que são livres de impurezas fluorescentes na proteína, DNA e preparações buffer. Filtrar todos os buffers através de uma membrana M 0,2 para evitar entupimento dos stopped-flow com partículas.
- Se o fluoróforo absorve a luz visível, a preparação ea experiência deve ser realizada sob condições de baixa luminosidade.
2. Instrumento para a preparação MSH2 MSH6-DNA-binding cinética
Um instrumento de stopped-flow é bastante simples, em princípio. Ele usa um motor de acionamento para empurrar rapidamente duas soluções em seringas de disco em um dispositivo de mistura, a solução mista, então, flui em uma célula de observação para coleta de dados (Fig. 3). Usamos o KinTek stopped-flow, o que exige baixo volume de amostra, permite a detecção única ou seqüencial mistura de reagentes, de uma variedade de sinais ópticos, e é muito fácil de usar. Stopped-flow instrumentos estão disponíveis a partir de vários outros fabricantes também.
- A fim de preparar o instrumento stopped-flow para os experimentos, verifique se o computador eo controlador estão desligados. Ligue o banho de água circulante conjunto à temperatura ambiente (25 graus; C) para esfriar a lâmpada. Acender a lâmpada. Definir o monocromador ao comprimento de onda de excitação desejado (315 nm, no caso de 2-aminopurina). Girar a roda de fenda com a largura de fenda desejado (empiricamente equilíbrio de excitação fluoróforo alta com fotobranqueamento baixo). Ligue o controlador eo computador. Ligue o banho de água circulante para encher a camisa de água que mantém os reagentes a uma temperatura desejada durante o experimento (30 ° C em caso de S. cerevisiae MSH2-MSH6).
- Em seguida, execute o programa parou de fluir. Ligue o detector de escolha, que neste caso é um tubo fotomultiplicador (PMT) com um filtro de interferência apropriado para o fluoróforo (350 nm de corte do filtro em caso de 2-aminopurina). Aplique a tensão no PMT. Medir a corrente de escuro para corrigir qualquer ruído de fundo elétrica.
- As seringas stopped-flow de unidade e de células de observação devem ser lavados antes de carregar as amostras. Definir a Válvula de carregamento de amostras para a posição LOAD. Encher uma seringa de 1ml com água, deionizada filtrado, anexá-lo ao porto de carregamento localizado abaixo da seringa drive, e manualmente empurrar a água entre as duas seringas algumas vezes. Repita o processo duas vezes para cada seringa unidade a ser utilizada no experimento. Em seguida, preencha as seringas unidade com água para lavar a célula de observação. Interruptor da válvula de carregamento de amostras para a posição FIRE. Use a unidade Seringa Ajustecomando, que controla o motor de acionamento, e placa inferior da unidade para empurrar a água através da célula de observação e na linha de saída. Tome cuidado para não empurrar o êmbolo até o fim da seringa unidade. Levante a placa de drive. Interruptor da válvula para a posição LOAD. Manualmente lavar as seringas com o tampão de reação e deixar vazia. O instrumento está pronto para uso.
3. MSH2-MSH6 DNA experiência de ligação e análise de dados
- Transferência de cada amostra do tubo a uma seringa ml frescos 1. Anexar cada seringa de amostra para um porto de carregamento e empurre a solução para a seringa unidade. Ter o cuidado de remover todas as bolhas de ar manualmente empurrando a solução entre as duas seringas algumas vezes com pausas intermitentes. Inferior da placa da unidade até que os contatos na parte superior da unidade de seringas. Deixe os reagentes atinjam a temperatura ambiente por alguns minutos.
- Para a coleta de dados, abra o Tempo Set / janela de Canais, selecione o canal de coleta de dados (PMT), o modo de análise de dados (fluorescência), eo número de traços (Shots) a recolher. Digite o tempo de coleta de dados durante o qual os 1.000 pontos de dados serão coletados. Uma reação desconhecida devem ser monitorados durante vários segundos, a fim de detectar qualquer fases lento. Empiricamente estimar o tempo necessário para atingir o equilíbrio ou estado estacionário e definir o tempo de coleta de dados para ≥ 6 meias-vidas. No caso de MSH2-MSH6 o período ideal é de 2 segundos para G: cinética de incompatibilidade T vinculativo e 60 segundos para G: T dissociação cinética. Agora defina a válvula para a posição FIRE e clique no botão Coletar dados. Esta ação inicia-mistura de MSH2 MSH6 e DNA, a entrada da reação na célula de observação, excitação do fluoróforo 2-aminopurina e coleta do sinal de fluorescência ao longo do tempo. Coletar pelo menos 5 traços cinética para obter dados de alta qualidade e salvar o arquivo.
- Quando a experiência é completa, por sua vez da lâmpada. Lavar as seringas e célula de observação com água como descrito anteriormente. Então, desligue o resto do equipamento, exceto para o banho de água circulante. A água é distribuída por mais 15 minutos para esfriar a lâmpada.
- Operações matemáticas e ajuste dos dados pode ser realizada com o software KinTek em si, a fim de obter um sentido da cinética de reação durante o experimento. Análise mais aprofundada também pode ser realizada pela média de múltiplos traços cinética e salvar e exportar o arquivo em média, a outros dados software de análise / gráficos.
4. Resultados representativos para MSH2-MSH6 DNA cinética de ligação
Dados cinéticos MSH2-MSH6 interações com G: T DNA incompatibilidade, pode ser adequado para uma única função exponencial e produzir um k ritmo rápido de ligação constante ON perto de 3 x 10 7 M 1 segundo-1 (Fig. 4A) e uma lenta dissociação constante k de 0,012 OFF -1 segundo (Fig. 4B), que revela que o MSH2-MSH6 liga um G: Incompatibilidade de T rapidamente e forma um complexo muito estável com uma meia vida próxima a 60 segundos 13.
B. Medição de MSH2-ATPase MSH6 Cinética
1. Preparação de amostras para o MSH2-MSH6 ensaio de cinética de ATPase
- Prepare-MSH2 MSH6 e reagentes DNA como descrito anteriormente, utilizando DNA não marcado. Além disso, purificar a proteína Binding fosfato (PBP) do E. coli e rotulá-la com o fluoróforo MDCC (Fig. 5) 14,15. MDCC-PBP liga fosfato livre rapidamente (k ON equivale a 1 x 10 8 M -1 segundo -1) e com alta afinidade (K D = 100 nM), resultando em um aumento dramático no MDCC de fluorescência (Fig. 6). MDCC-PBP é, portanto, um repórter robusto de pré-hidrólise constante estado de ATP e liberação de fosfato cinética 14,15. Note-se que é essencial para minimizar os níveis de fosfato de fundo para este ensaio, portanto, o uso do vidro deve ser estritamente evitada em todas as fases de preparação de reagentes.
- Prepare uma amostra com 4 mm de MSH2-MSH6 proteína com ou sem 6 mM G: T DNA, que produz 2 mM mM e 3 concentrações finais em um único experimento com mistura 1:1 de mistura. Note-se que experimentos pré-estado estacionário requerem concentrações de enzima de alta desde o sinal de interesse é de um volume de negócios única ou a primeira poucos turnovers catalítico. Prepare outra amostra contendo 1 mM recém dissolvida ATP e 20 repórter MDCC-PBP mM. Adicionar 0,10 Unidades / ml de purina nucleosídeo fosforilase e 200 mM 7-methylguanosine às amostras, que serve para limpar qualquer fosfato de contaminantes. Incubar as amostras no gelo por pelo menos 20 minutos (Tabela 2).
2. Instrumento para a preparação MSH2-ATPase MSH6 cinética
- Prepare o instrumento stopped-flow para experimentos como descrito anteriormente. Além disso, limpar contaminantes fosfato do disco seringas com 0,5 Unidades / ml purina nucleoside fosforilase e 200 mM 7 methylguanosine-por 20 minutos. Definir o comprimento de onda de excitação a 425 nm e 450 nm usar um cut-off do filtro com a PMT para a detecção de MDCC-PBP fluorescência.
3. Experimento MSH2-MSH6 ATPase e análise de dados
- Carregar o disco seringas com as amostras conforme descrito anteriormente. Clique em Coleta de Dados para misturar-MSH2 MSH6 com ATP e MDCC-PBP e liberação de fosfato monitor MSH2-MSH6 eo aumento associado em MDCC-PBP fluorescência ao longo do tempo. Coletar pelo menos 5 traços cinética para obter uma alta qualidade de conjunto de dados e salve o arquivo. Média de múltiplos traços cinética e exportar o arquivo de dados para análise.
- Prepare uma curva de calibração para determinar a relação linear entre a concentração de fosfato e MDCC-PBP fluorescência. , A fim de fazê-lo, misture MDCC-PBP com diferentes concentrações de fosfato nas mesmas condições experimentais na stopped-flow, e máxima medida MDCC-PBP fluorescência para cada concentração de fosfato.
- Trama a fluorescência MDCC-PBP máximo comparativamente a cada concentração de fosfato para a curva de calibração (Fig. 7) e usar a inclinação para obter concentração de fosfato nas reações MSH2-MSH6. Concentração de fosfato trama contra o tempo e ajustar os dados a uma função exponencial e linear. Esta função descreve uma explosão de pré-hidrólise constante estado de ATP e liberação de fosfato seguido pela fase de estado linear constante da reação.
4. Resultados representativos para MSH2-ATPase MSH6 cinética
Os dados mostram que a cinética MSH2-MSH6 hidrolisa ATP e libera rapidamente o fosfato em 1,4 -1 em segundo lugar no volume de negócios primeiro catalítico. Esta fase é seguida por uma etapa lenta na reação que limita a um volume de negócios subseqüentes de 7 vezes mais lento gato k no estado estacionário de 0,2 -1 segundo (Fig. 8A). No entanto, quando MSH2-MSH6 é ligado ao DNA incompatíveis, a explosão de hidrólise de ATP e liberação de fosfato é suprimida, e MSH2-MSH6 permanece em um estado ATP ligado por um longo tempo.
Figura 1. Purificação de S. cerevisiae MSH2-MSH6 de E. coli. MSH2 e MSH6 genes foram clonados em vetor pET11a e sobre-expressa em E. coli BL21 (DE3) células. O complexo de proteína foi purificada por cromatografia em coluna sobre SP-sepharose, heparina, e Q-Sepharose resinas. SDS-PAGE análise mostrado aqui contém frações protéicas de uma coluna Q-Sepharose.
. Figura 2 Complementar single-stranded DNAs são recozidos para formar um duplex contendo G: Incompatibilidade de T com uma adenosina adjacentes (para experimentos ATPase) ou 2-aminopurina analógico base de fluorescentes de adenosina (para experiências de DNA binding).
Figura 3. Fluxo de reagentes no KinTek parou de fluxo durante uma experiência única de mistura.
Figura 4a Cinética de MSH2-MSH6 interação com um G:. Incompatibilidade T. Mistura de DNA duplex (0,12 mM), contendo um G: T adjacente a 2 aminopurina com MSH2-MSH6 (0,8 mM) leva a um aumento na fluorescência ao longo do tempo, e produz uma taxa de k constante bimolecular ON = 2,4 10 7 M -1 s -1 para a interação.
Figura 4b Cinética de MSH2-MSH6 interação com um G:. Incompatibilidade T. Mistura pré-formada MSH2-MSH6 G: T (2-Ap) complexas, com excesso de unlabeled G: T DNA (8 mM) que qualquer armadilhas livre MSH2-MSH6 leva à diminuição da fluorescência ao longo do tempo, e produz uma taxa de dissociação lenta constante, k OFF = 0,012 s -1, indicando um complexo estável com uma meia vida longa de aproximadamente 60 segundos. Concentrações finais: 0,4 mM MSH2-MSH6, 0,06 mM DNA marcado, 4 mM unlabeled G: T armadilha DNA.
Figura 5. MDCC-PBP preparação. SDS-PAGE análise de E. coli da proteína de ligação de fosfato (PBP), purificada e rotulado com o fluoróforo MDCC.
Figura 6. MDCC-PBP resposta ao fosfato. Titulação do MDCC-PBP com fosfato (Pi) resulta em aumento de fluorescência MDCC.
Figura 7a. Preparação do fosfato (Pi) curva padrão. MDCC-PBP (20 mM) é misturado com diferentes quantidades de Pi (0-8 M) umad fluorescência medidos ao longo do tempo até que o equilíbrio seja atingido. Concentrações finais: 10 mM MDCC-PBP, 0-4 mM Pi.
Figura 7b. Preparação do fosfato (Pi) curva padrão. Máxima MDCC-PBP fluorescência é plotado contra [Pi] para produzir uma curva padrão. A inclinação da linha (0,383 mM -1, neste caso) é usado para converter MDCC-PBP fluorescência em concentração de Pi.
Figura 8a. MSH2-MSH6 cinética ATPase. MSH2-MSH6 (4 mM), na ausência G: T DNA, misturados rapidamente com ATP (1 mM) e MDCC-PBP (20 mM) exibe uma explosão de hidrólise de ATP e liberar Pi. Análise de dados rende a taxa (k = 1,4 hidrólise s -1) e amplitude (2 mM; um site por MSH2-MSH6) da fase de explosão, que é seguido por uma fase linear estado, estável a uma taxa de 0,4 s M - 1 (k cat = 0,2 s -1).
Figura 8b. MSH2-ATPase MSH6 cinética. Além de G: T DNA para a reação (6 mM) suprime a explosão de hidrólise de ATP, estabilizando o complexo em um estado ATP-bound. Concentrações finais: 2 mM MSH2-MSH6, 500 mM ATP, DNA 3 mM, 10 mM MDCC-PBP. Cinética de explosão estão aptos pela seguinte equação: [Pi] = A 0 e-t k + Vt, onde [Pi] é a concentração de fosfato, A 0 é a amplitude estourar, k é a taxa de burst observado constante e V é a velocidade da a fase linear (k cat = V / [MSH2-MSH6]).
| Amostra | Proteína | DNA | ||||
| Reagente | Estoque | Trabalhar | Vol, mL | Estoque | Trabalhar | Vol, mL |
| MSH2-MSH6 | 5 mM | 0,8 mM | 64 | - | - | - |
| 2ApG: T | - | - | - | 10 mM | 0,12 mM | 4,8 |
| amortecedor | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 |
| 2 O DDH | - | - | 296 | - | - | 355 |
| Total | 400 | 400 | ||||
Reação Tabela 1 DNA de ligação
| Amostra | Proteína | DNA-proteína | ATP | ||||||
| Reagente | Estoque | Trabalhar | Vol, mL | Estoque | Trabalhar | Vol, mL | Estoque | Trabalhar | Vol, mL |
| MSH2-MSH6 | 20 mM | 4 mM | 80 | 20 mM | 4 mM | 80 | - | - | - |
| G: T | - | - | - | 100 | 6 | 24 | - | - | - |
| ATP | - | - | - | - | - | - | 50 mM | 1 mM | 8 |
| 7-MEG | 250x | 1x | 1,6 | 250x | 1x | 1,6 | 250x | 1x | 1,6 |
| PNPase | 100x | 1x | 4 | 100x | 1x | 4 | 100x | 1x | 4 |
| PBP-MDCC | 150 mM | 20 mM | 53,3 | 150 mM | 20 mM | 53,3 | - | - | - |
| Amortecedor | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 | 10x | 1x | 40 |
| 2 O DDH | - | - | 221 | - | - | 197 | - | - | 346 |
| Total | 400 | 400 | 400 | ||||||
Tabela 2 reação ATPase
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Discussion
O exemplo de uma proteína de ligação incompatibilidade DNA aqui descrita ilustra o poder e utilidade dos métodos transientes cinética para estudar os mecanismos de moléculas biológicas. Stopped-flow medições na escala de volume de negócios único momento, desde evidência inequívoca para a ligação rápida e específica de MSH2-MSH6 proteína para um par de bases incompatíveis e formação de uma vida longa complexo DNA-proteína X na reação 9. Além disso, parou de fluxo (e saciar-flow) análise da atividade ATPase forneceram evidências diretas para MSH2-MSH6 mudar para uma conformação ATP-bound após DNA incompatíveis ligação 11,16. Essa opção é a hipótese de sinal de reparo do DNA 17,18. Tais dados de alta resolução cinética, juntamente com complementares de alta resolução dados estruturais são essenciais para avançar na compreensão da função de macromoléculas.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão de CARREIRA NSF (MMH), um Barry M. Goldwater bolsa (FNB) e um Prêmio de Pesquisa ASBMB Graduação (CWD). O clone de sobre-expressão do PBP foi gentilmente cedido pelo Dr. Martin Webb (MRC, UK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 G | DNA Sequence: 5’- ATT TCC TTC AGC AGA TAT G T A CCA TAC TGA TTC ACA T -3’ | ||
| 37 T (2-Ap) | DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA TApT ATC TGC TGA AGG AAA T -3’ | ||
| 37 T | DNA Sequence: 5’- ATG TGA ATC AGT ATG GTA T A T ATC TGC TGA AGG AAA T -3’ |
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