Summary
SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى.
Abstract
SNAP - CLIP العلامة والعلامة ، نظم التوسيم البروتين تمكين محددة ، المرفق من الجزيئات التساهمية ، بما في ذلك الأصباغ الفلورية ، وبروتين من الاهتمام في الخلايا الحية. هذه النظم نقدم مجموعة واسعة من ركائز الفلورسنت الأمثل لمجموعة من الأجهزة التصوير. وأعرب عن مرة واحدة مستنسخة ، ويمكن استخدام هذا البروتين المفتاحية مع مجموعة متنوعة من ركائز لتطبيقات عديدة المصب دون الحاجة إلى استنساخ مرة أخرى. هناك نوعان من الخطوات لاستخدام هذا النظام : الاستنساخ والتعبير عن بروتين من الفائدة انصهار SNAP - العلامة ، والوسم من الانصهار مع الركيزة SNAP - علامة الاختيار. الأداة الإضافية العلامة هو بروتين صغير استنادا O الإنسان
Protocol
الطلاء CHO - K1 خلايا :
- إضافة 50 100μl من خلايا K1 CHO التي تم trypsinized وفقا لبروتوكولات موحدة ل6ml من اكتمال F - 12K.
- مزيج تعليق خلية pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات ، ثم قسامة 300 ميكرولتر من التعليق على كل خلية trypsinized جيدا معقمة 8 غرفة مختبر تيك ساترة يحتل هيئة تشريعية الثانية مع 1.5 # البورسليكات ساترة غرف (Nalgene نونك الباحث ؛ المنتج # 155409 ؛ الكثير : 100808-8-0).
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 بين عشية وضحاها.
عابر ترنسفكأيشن من CHO - K1 مع خلايا pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - :
- التحقق من خلية ثقافة غرف المصنفة في اليوم السابق للبحث عن كثافة الخلايا والصحة.
- تسمية العدد المناسب من الأنابيب microfuge.
- في التدفق الصفحي هود ، إعداد الخلائط ترنسفكأيشن المعقدة وفقا للرسم البياني عينة التالية ، وذلك باستخدام إما 0.3 ميكروغرام pSNAP ADBR2 - DNA البلازميد أو التحكم 0.3 ميكروغرام من الحمض النووي للمراقبة pSNAP - H2B البلازميد ، 1 ميكرولتر من TransPass D2 و 1 ميكرولتر الخامس TransPass في رد الفعل.
البلازميد عدد من ردود الفعل ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة ميكرولتر من D2 TransPass ميكرولتر الخامس TransPass ميكرولتر من DNA البلازميد ميكرولتر من D2/reaction TransPass ميكرولتر الخامس TransPass / رد فعل نانوغرام من الحمض النووي / رد فعل اضرب الحمض النووي. (نانوغرام / ميكرولتر) ميكرولتر من DNA البلازميد / رد فعل SNAP - ADRb2 5 236.5 5 5 3.5 1 1 300 472.34 0.7 H2B - SNAP 5 237 5 5 3 1 1 300 515.89 0.6 همية 5 240 5 5 0 1 1 0 0 0 Untransfected 5 250 0 0 0 0 0 0 0 0 - أولا ، مزيج الحرة المصل F - 12K مع الحمض النووي للبلازميد المناسبة ، ثم إضافة الكاشف TransPass ترنسفكأيشن D2 ، ثم إضافة ترنسفكأيشن الخامس TransPass الكاشف. مزج المكونات جيدا pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات بعد إضافة كل كاشف.
- احتضان تفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- أثناء الحضانة ، وغسل خلايا مرة واحدة مع 600 ميكرولتر من DMEM كاملة وإضافة 450 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى كل عينة.
- إضافة 50 ميكروليتر من خليط معقد ترنسفكأيشن لكل عينة ، ببطء وبطريقة حكيمة المنسدلة.
- احتضان نماذج ليلا 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2.
SNAP الخلوي TMR صفها نجمة خلايا - K1 CHO Transfected عابر مع pSNAP - ADRB2 وpSNAP H2B - :
- إزالة بعناية وسائل الإعلام ترنسفكأيشن تعقيدا من كل عينة عن طريق الشفط فراغ. غسل الخلايا مرتين مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K واستبدال وسائل الإعلام في كل بئر مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K.
- مزيج سائل الإعلام وسم الصبغة بإضافة 995 ميكروليتر من اكتمال 12K - F و 51 ميكرولتر 0.6 مم SNAP سيل الركيزة TMR ستار. وينبغي تركيز النهائي من SNAP سيل ستار TMR يكون 3mM. ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط بعد إضافة الركيزة.
- إزالة بعناية وسائط النمو من عينات وإضافة 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام الوسم صبغ كل جانب. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة.
- بينما تحتضن العينات ، وإعداد هويشت 33342 حل لتلطيخ النووي لعينات عن طريق خلط 1 ميكرولتر من هويشت 33342 ، trihydrochloride ، هيدرات (10 ملغ / مل حل في الماء و 16.2 ملي حل ؛ مجسات Invitrogen الجزيئية) في 10 مل من اكتمال 12K - F .
- إزالة وسائل الإعلام من جميع العينات وإضافة 600 ميكرولتر من محلول مخفف لهويشت كل عينة. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 5 دقائق.
- غسل العينات ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من اكتمال F - 12K.
- احتضان العينات عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة إضافية للسماح لنشر fluorophore الفردية خارج الخلايا.
- بعد 30 دقيقة ، وتغير وسائل الإعلام على عينات SNAP سيل للمرة الأخيرة ، والشروع في التصوير.
- صورة الخلايا باستخدام مجهر زايس Apotome 200M Axiovert الفلورسنت.
ممثل النتائج
الشكل 1. هنابعض النتائج ممثل الفلورسنت التصوير باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية من الخلايا COS - 7 العيش التي هي تعبير عن SNAP - علامة اندماج. هذه الصورة الأولى يظهر يعيش COS - 7 - pSNAP معربا عن الخلايا H2B (النووية هيستون) المسمى مع الخلوي SNAP TMR ستار. ولدت في بناء pSNAP - H2B باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان الوردي يوضح التراكب من مضان أحمر حيث بروتين موجود في هيستون بالإضافة إلى مضان زرقاء تشير إلى النواة. ومن الواضح أن وسهولة التعرف على التعبير عن بروتين H2B.
الشكلين 2 و 3 ، وهذه الصور تظهر المقبلتين يعيش COS - 7 خلايا transfected عابر مع pSNAP - ADRβ2.
وصفت الخلايا مع الخلوي SNAP TMR ستار (الحمراء) ، وcounterstained مع هويشت 33342 (الأزرق). ولدت في بناء pSNAP - ADRβ2 باستخدام العلامة pSNAP - (م) النواقل. وصفت الخلايا مع SNAP سيل ستار TMR لمدة 30 دقيقة مع وcounterstained هويشت 33342 (أزرق) للنوى. ومضان أحمر يدل على وجود بروتين سطح الخلية ADRB2 مستقبلات اللون الأزرق بينما يحدد مضان النواة.
Discussion
هناك العديد من المتغيرات التي تؤثر على النتائج لوحظ كثافة مثل تركيز الليزر ، وقدرات المعدات والعدسة المستخدمة ، إلخ صمود للضوء لfluorophore يحدد مدى السرعة التي يجب أن يتم القبض مضان قبل أن يتلاشى.
هذه الطريقة لوضع العلامات البروتين هي متعددة ومناسبة للعديد من التطبيقات. SNAP - CLIP العلامة والعلامة التكنولوجيات لوضع العلامات المحددة للبروتينات اندماج مع تحقيقات الاصطناعية تمكين مختلف جوانب وظيفة البروتين ، بما في ذلك مجموعة متنوعة من العمليات الحيوية في الخلايا الحية وlysates في الخلية. SNAP ، CLIP ، وMCP ACP - العلامة تكنولوجيات توفير البساطة وبراعة غير عادية في التصوير من البروتينات في الخلايا الحية والثابتة ولدراسة البروتينات في المختبر. إنشاء بناء جين واحد ينتج بروتين قادر على الانصهار الموسومة تشكيل الروابط التساهمية لمجموعة متنوعة من الفئات الوظيفية ، بما في ذلك fluorophores ، البيوتين ، أو الخرز. يجب أن تكون مستنسخة من البروتين وأعربت عن الفائدة مرة واحدة فقط ومن ثم يمكن استخدامها في الانصهار مع مجموعة متنوعة من ركائز الفلورسنت لتطبيقات عديدة مثل المصب الوسم في وقت واحد من البروتين داخل الخلايا الحية ، والترجمة البروتين إزفاء ، نبض مطاردة التجارب والدراسات استيعاب مستقبلات وانتقائية العلامات سطح الخلية والبروتين هدم المقايسات ، كشف عن البروتين في SDS - PAGE ، التدفق الخلوي ، وارتفاع إنتاجية المقايسات ملزمة في لوحات microtiter ، والتجارب تفاعل جهاز الاستشعار البيولوجي ، والحنق على أساس المقايسات ملزمة.
Disclosures
ويعمل المؤلفون من خلال نيو إنجلاند Biolabs التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.
Acknowledgments
كاي جونسون
ايفان كوريا
أندرياس بريشت
كاترين Müentener
كريس نورين
أحد لوه
مينج شو
تيودور ديفيز
سالفاتوري Russello
أيهوا تشانغ
الإنكا غوش
اليسا Maunus
نيكولاس ابارث
جيمس ماكفارلاند
جون Buswell
بريندا ديزموند
جيمس Ellard
دون مشط
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-K1 Cells | ATCC | CCL-61 | |
| Serum free F-12K | |||
| Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers | Nalge Nunc international | 155409 | Lot: 100808-8-0 |
| DMEM | |||
| H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution) | Invitrogen | H3570 | 470519 |
| Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transpass V | New England Biolabs | M2561S | 0030709 |
| Transpass D2 | New England Biolabs | M2554S | 0060802 |
| SNAP-Cell TMR Star | New England Biolabs | S9105S | 0010811 |
| pSNAP-ADBR2 Control Plasmid | New England Biolabs | N9178S | 0010811 |
| pSNAP-H2B Control Plasmid | New England Biolabs | N9179S | 0010811 |
References
- Johnsson, K. Visualizing biochemical activities in living cells. Nat Chem Biol. 5, 63-65 (2009).
- Johnsson, K. SNAP-tag Technologies: Novel Tools to Study Protein Function. NEB Expressions. 3.3, 1-3 (2008).
