Fluoreszenzmarkierung von COS-7 mit dem Ausdruck SNAP-tag-Fusionsproteinen für das Live Cell Imaging

Summary

SNAP-tag und CLIP-tag Proteinmarkierung Systeme ermöglichen die spezifische, kovalente Bindung von Molekülen, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, um ein Protein von Interesse in lebenden Zellen. Einmal kloniert und exprimiert, kann die markierte Protein mit einer Vielzahl von Substraten für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen, ohne sich erneut Klon verwendet werden.

Abstract

SNAP-tag und CLIP-tag Proteinmarkierung Systeme ermöglichen die spezifische, kovalente Bindung von Molekülen, einschließlich Fluoreszenzfarbstoffe, um ein Protein von Interesse in lebenden Zellen. Diese Systeme bieten eine breite Auswahl an fluoreszierende Substrate für eine Reihe von Imaging-Instrumenten optimiert. Einmal kloniert und exprimiert, kann die markierte Protein mit einer Vielzahl von Substraten für zahlreiche nachgelagerte Anwendungen, ohne sich erneut Klon verwendet werden. Es gibt zwei Schritte, um mit diesem System: Klonierung und Expression des Proteins von Interesse als SNAP-tag-Fusion, und die Kennzeichnung der Fusion mit der SNAP-tag Substrat der Wahl. Die SNAP-tag ist ein kleines Protein auf die menschliche O Basis

Protocol

Plating CHO-K1-Zellen:

1. Add 50-100 &mgr; von CHO-K1-Zellen, die nach Standardprotokollen auf 6ml komplette F-12K wurden trypsiniert.
2. Mix Zellsuspension durch Auf-und Abpipettieren mehrmals, dann aliquoten 300 pl trypsiniert Zellsuspension in jede Vertiefung einer sterilen 8-Kammer-Lab-Tek II Chambered Deckglas mit # 1.5 Borosilikat Deckglas Kammern (Nalgene Nunc Int;. Product # 155409; Lot: 100808-8-0).
3. Inkubieren Proben bei 37 ° C, 5% CO ₂ über Nacht.

Transiente Transfektion von CHO-K1-Zellen mit pSNAP-ADRB2 und pSNAP-H2B:

1. Überprüfen Sie die Zellkulturkammern am Vortag ausgesät, um für die Zelldichte und Gesundheit suchen.
2. Beschriften Sie die entsprechende Anzahl von Mikrozentrifugenröhrchen.
3. In einer Sterilbank, bis Transfektion komplexe Gemische nach dem folgenden Beispiel-Tabelle setzen, entweder mit 0,3 ug pSNAP-ADBR2 Kontroll-Plasmid-DNA oder 0,3 pg pSNAP-H2B Kontroll-Plasmid-DNA, 1 ul Transpass D2 und 1 ul Transpass V pro Reaktion.

   Plasmid	Anzahl der Reaktionen	ul Serum-freiem Medium	ul Transpass D2	ul Transpass V	ul von Plasmid-DNA	ul Transpass D2/reaction	ul Transpass V / Reaktion	ng des DNA / Reaktion	DNA konz. (Ng / ul)	ul von Plasmid-DNA / Reaktion
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   Verspotten	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Transfizierte	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Zunächst mischen Sie die Serum-freien F-12K mit dem entsprechenden Plasmid-DNA, fügen Sie dann die Transpass D2 Transfektionsreagenz, fügen Sie dann die Transpass V Transfektionsreagenz. Mischen Sie die Komponenten gut durch Auf-und Abpipettieren vorsichtig mehrmals nach der Zugabe der einzelnen Reagenzien.
5. Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
6. Während der Inkubation waschen Sie die Zellen einmal mit 600 ul von kompletten DMEM und fügen 450 ul DMEM komplett zu jeder Probe.
7. Add 50 ul der Transfektion komplexen Mischung zu jeder Probe, langsam und in einem Drop-weise Mode.
8. Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 ° C, 5% CO _2.

SNAP-Cell TMR Star-Kennzeichnung von CHO-K1 Zellen transient mit pSNAP-ADRB2 und pSNAP-H2B Transfizierte:

1. Entfernen Sie vorsichtig die Transfektion komplexen Medien von jeder Probe mittels Vakuum abgesaugt. Wash Zellen zweimal mit 600 ul der kompletten F-12K und ersetzen Medien in jede Vertiefung mit 600 ul der kompletten F-12K.
2. Mix Farbstoffmarkierung Medien, indem 995 ul der kompletten F-12K und 51 ul 0,6 mM SNAP-Cell TMR-Star Substrat. Die Endkonzentration von SNAP-Cell TMR-Star sollte 3mm. Pipette nach oben und unten mehrere Male, um nach der Zugabe von Substrat-Mix.
3. Entfernen Sie vorsichtig das Wachstum Medien von Proben und 200 ul der Farbstoff Kennzeichnung Medien in jede Vertiefung. Inkubieren Proben bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 30 Minuten.
4. Während Proben inkubiert werden, bereiten Hoechst 33342-Lösung für die Kernfärbung der Proben durch Mischen von 1 ul der Hoechst 33342, Tri-, Trihydrat (10 mg / ml Lösung in Wasser, 16,2 mM Lösung; Invitrogen Molecular Probes) in 10 ml komplettem F-12K .
5. Entfernen Sie die Medien aus aller Proben und fügen 600 ul der verdünnten Hoechst-Lösung zu jeder Probe. Inkubieren Proben bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 5 Minuten.
6. Wash Proben dreimal mit 600 ul der kompletten F-12K.
7. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C, 5% CO ₂ für zusätzliche 30 Minuten, damit Personengesellschaften Fluorophor zu diffundieren aus den Zellen heraus.
8. Nach 30 Minuten wechseln die Medien über die SNAP-Cell-Proben ein letztes Mal, und fahren Sie Bildgebung.
9. Bild der Zellen unter Verwendung eines Zeiss Axiovert 200M Apotome Fluoreszenzmikroskop.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Hier sindeinige repräsentative Ergebnisse der Fluoreszenz-Imaging mit Standard-Fluoreszenz-Mikroskopie von lebenden COS-7 Zellen, die zum Ausdruck SNAP-tag Fusionen werden. Das erste Bild zeigt Live-COS-7-Zellen, die pSNAP-H2B (nuclear Histon) mit SNAP-Cell TMR-Star bezeichnet. Die pSNAP-H2B-Konstrukt wurde mit Hilfe des pSNAP-tag (m)-Vektor. Die Zellen wurden mit SNAP-Cell TMR-Star für 30 Minuten beschriftet und mit Hoechst 33342 (blau) für Kerne. Die rosa Fluoreszenz zeigt die Überlagerung der roten Fluoreszenz, wo Histon-Protein vorhanden ist zusätzlich zu den blaue Fluoreszenz zeigt den Kern. Der Ausdruck der H2B Protein ist klar und leicht zu identifizieren.

Abbildungen 2 und 3. Die nächsten beiden Bilder zeigen Live-COS-7 Zellen transient mit pSNAP-ADRβ2 transfiziert.
Die Zellen wurden mit SNAP-Cell TMR-Star (rot) markiert und mit Hoechst 33342 (blau). Die pSNAP-ADRβ2 Konstrukt wurde mit Hilfe des pSNAP-tag (m)-Vektor. Die Zellen wurden mit SNAP-Cell TMR-Star für 30 Minuten beschriftet und mit Hoechst 33342 (blau) für Kerne. Die rote Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von Zelloberflächen-Rezeptor-Protein ADRB2 während blaue Fluoreszenz identifiziert den Kern.

Discussion

Es gibt mehrere Variablen, die die beobachteten Ergebnisse wie Fokus, Laserintensität, Geräte-Funktionen, verwendeten Objektiv, etc. Die Photostabilität des Fluorophors bestimmt, wie schnell die Fluoreszenz müssen, bevor sie verblassen erfasst werden.

Diese Methode der Protein-Kennzeichnung ist vielseitig und für viele Anwendungen geeignet. SNAP-tag und CLIP-tag-Technologien für die spezifische Markierung von Fusionsproteinen mit synthetischen Sonden ermöglichen die verschiedenen Aspekte der Funktion von Proteinen, einschließlich einer Vielzahl von dynamischen Prozessen in lebenden Zellen und in Zelllysaten. SNAP-, CLIP-, MCP-und AKP-tag-Technologien bieten Einfachheit und außergewöhnliche Vielseitigkeit für die Bildgebung von Proteinen in lebenden und fixierten Zellen und die Untersuchung von Proteinen in vitro. Die Schaffung eines einheitlichen Genkonstrukt ergibt eine getaggt Fusionsprotein in der Lage, eine kovalente Verknüpfung mit einer Vielzahl von funktionellen Gruppen, einschließlich der Fluorophore, Biotin oder Perlen. Das Protein von Interesse sind kloniert und nur einmal und dann die Fusion kann mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Substrate für zahlreiche Downstream-Anwendungen wie zB die gleichzeitige Proteinmarkierung in lebenden Zellen, Protein-Lokalisation und Translokation, Puls-Chase-Experimente, Rezeptor-Internalisierung Studien verwendet werden , selektive Zelloberfläche Kennzeichnung, Protein-Pull-Down-Assays, Protein-Nachweis in SDS-PAGE, Durchflusszytometrie, High-Throughput-Bindungs-Assays in Mikrotiterplatten, Biosensor-Interaktion Experimente und FRET-basierten Bindungsassays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-K1 Cells	ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers	Nalge Nunc international	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid	New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid	New England Biolabs	N9179S	0010811