Fluorescerande märkning av COS-7 uttrycka SNAP-tagg fusionsproteiner för levande cell imaging

Summary

SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen.

Abstract

SNAP-tag och clip-taggen protein märkningssystem aktivera specifika, kovalent bindning av molekyler inklusive fluorescerande färger, till ett protein av intresse i levande celler. Dessa system erbjuder ett brett urval av fluorescerande substrat optimerade för en rad imaging instrumentering. När klonade och uttryckt kan taggade proteinet användas med en mängd av substrat för många efterföljande program utan att behöva klona igen. Det finns två steg för att använda detta system: kloning och uttryck av proteinet av intresse som ett SNAP-tagg fusion, och märkning av fusion med SNAP-taggen substrat val. Den SNAP-taggen är ett litet protein som bygger på mänskliga O

Protocol

Plätering CHO-K1 Celler:

1. Tillsätt 50-100μl av CHO-K1 celler som har trypsinized enligt standardprotokoll till 6 ml av kompletta F-12K.
2. Blanda cellsuspension genom att pipettera upp och ned flera gånger och sedan alikvot 300 ìl trypsinized cellsuspension i varje brunn på en steril 8-kammare Lab-Tek II Chambered Coverglass med # 1,5 borosilikat coverglass kammare (Nalgene Nunc int;. Produkt # 155.409; Vara: 100808-8-0).
3. Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO ₂ över en natt.

Övergående transfektion av CHO-K1 Celler med pSNAP-ADRB2 och pSNAP-H2B:

1. Kontrollera kamrarna cellodling seedade dagen innan för att leta efter celltätheten och hälsa.
2. Etikett lämpligt antal mikrofugrör rör.
3. I ett laminärt flöde huva, inrättat transfektion komplexa blandningar enligt följande exempel diagram, med antingen 0,3 mikrogram pSNAP-ADBR2 Kontroll Plasmid DNA eller 0,3 mikrogram pSNAP-H2B Kontroll Plasmid DNA, 1 ìl TransPass D2 och 1 l av TransPass V per reaktion.

   plasmid	antal reaktioner	l av serum-fria medel	ìl TransPass D2	ìl TransPass V	ìl av plasmid-DNA	ìl TransPass D2/reaction	ìl TransPass V / reaktion	ng DNA / reaktion	DNA-konc. (Ng / l)	ìl av plasmid-DNA / reaktion
   SNAP-ADRb2	5	236,5	5	5	3,5	1	1	300	472,34	0,7
   H2B-SNAP	5	237	5	5	3	1	1	300	515,89	0,6
   Mock	5	240	5	5	0	1	1	0	0	0
   Untransfected	5	250	0	0	0	0	0	0	0	0

4. Först, blanda serum fria F-12K med lämplig plasmid-DNA, tillsätt sedan TransPass D2 Transfektion Reagens, tillsätt sedan TransPass V Transfektion reagens. Blanda komponenterna och genom att pipettera upp och ned försiktigt flera gånger efter tillsats av varje reagens.
5. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur i 30 minuter.
6. Under inkubation, tvätta cellerna en gång med 600 l av kompletta DMEM och tillsätt 450 l av kompletta DMEM till varje prov.
7. Tillsätt 50 ìl av transfektion komplexa blandningen till varje prov, långsamt och i en droppvis mode.
8. Inkubera proverna över natten vid 37 ° C, 5% CO _2.

SNAP-Cell TMR Star-märkning av CHO-K1-celler övergående transfererats med pSNAP-ADRB2 och pSNAP-H2B:

1. Ta försiktigt bort transfektion komplexa media från varje prov med vakuum. Tvätta cellerna två gånger med 600 l av komplett F-12K och ersätta media i varje brunn med 600 l av komplett F-12K.
2. Blanda färg märkning medierna genom att tillsätta 995 l av komplett F-12K och 51 l 0,6 mm snap-Cell TMR-Star substrat. Den slutliga koncentrationen av SNAP-Cell TMR-stjärna ska vara 3 mm. Pipettera upp och ned flera gånger för att blanda efter tillsats av substrat.
3. Ta försiktigt bort tillväxten media från prover och tillsätt 200 l färgämne märkning media till varje brunn. Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO ₂ i 30 minuter.
4. Medan proverna ruva, förbereda Hoechst 33.342 lösning för nukleär färgning av prover genom att blanda 1 ìl Hoechst 33.342, trihydrochloride, trihydrat (10 mg / ml lösning i vatten, 16,2 mm lösning; Invitrogen molekylära sonder) i 10 ml komplett F-12K .
5. Ta bort materialet från alla prover och tillsätt 600 l av de utspädda Hoechst lösning till varje prov. Inkubera prov vid 37 ° C, 5% CO ₂ i 5 minuter.
6. Tvätta prover tre gånger med 600 l av komplett F-12K.
7. Inkubera proverna vid 37 ° C, 5% CO ₂ i ytterligare 30 minuter så att oregistrerade fluoroforen att sprida ut ur cellerna.
8. Efter 30 minuter ändra media på den SNAP-cellprover en sista gång och gå vidare till bildbehandling.
9. Bild cellerna med hjälp av en Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescerande mikroskop.

Representativa resultat

Figur 1. Här ärnågra representativa resultat av fluorescerande avbildning med hjälp av vanliga fluorescerande mikroskopi av levande COS-7 celler som uttrycker SNAP-taggen fusioner. Denna första bild visar leva COS-7 celler som uttrycker pSNAP-H2B (nukleära histoner) märkt med SNAP-Cell TMR-Star. Den pSNAP-H2B konstruera genererades med pSNAP-taggen (m) vektor. Cellerna var märkta med SNAP-Cell TMR-Star i 30 minuter och counterstained med Hoechst 33.342 (blå) för kärnor. Den rosa fluorescens visar en överlagring av röda fluorescens där histon protein finns i tillägg till den blå fluorescens som visar kärnan. Uttrycket för H2B protein är tydligt och lätt att identifiera.

Figur 2 och 3. Dessa två bilder visar leva COS-7 celler övergående transfekterade med pSNAP-ADRβ2.
Celler märkta med SNAP-Cell TMR-Star (röd) och counterstained med Hoechst 33.342 (blå). Den pSNAP-ADRβ2 konstruera genererades med pSNAP-taggen (m) vektor. Cellerna var märkta med SNAP-Cell TMR-Star i 30 minuter och counterstained med Hoechst 33.342 (blå) för kärnor. Den röda fluorescensen indikerar förekomst av cellyteproteiner protein ADRB2 medan blå fluorescens identifierar kärnan.

Discussion

Det finns flera variabler som påverkar observerade resultat som fokus, laser intensitet, utrustning kapacitet, objektiv etc. fotostabilitet av fluoroforen bestämmer hur snabbt fluorescens fångas innan de bleknar.

Denna metod för protein märkning är mångsidig och lämplig för många applikationer. SNAP-tag och clip-tagg teknik för särskild märkning av fusionsproteiner med syntetiska sonder att olika aspekter av proteiners funktion, bl.a. olika typer av dynamiska processer i levande celler och i cell lysates. SNAP-, CLIP-, MCP-och AVS-taggen teknik ger enkelhet och extra mångsidighet till avbildning av proteiner i levande och fasta celler och till studiet av proteiner in vitro. Skapandet av en enda gen konstruktion ger en taggad fusionsprotein i stånd att bilda ett kovalent koppling till en rad olika funktionella grupper, däribland fluoroforer, biotin, eller pärlor. Proteinet av intresse måste klonas och uttryckte bara en gång och sedan fusion kan användas med en rad olika fluorescerande substrat för många nedströms applikationer såsom samtidiga protein märkning inuti levande celler, protein lokalisering och translokation, puls-jakt experiment, receptor internalisering studier , selektiv cellytan märkning, protein dra ner analyser, protein upptäckt i SDS-PAGE, flödescytometri, med hög genomströmning bindande tester på mikrotiterplattor, Biosensor experiment interaktion och FRET-baserade bindande analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-K1 Cells	ATCC	CCL-61
Serum free F-12K
Lab-Tek II Chambered Coverglass with #1.5 borosilicate coverglass chambers	Nalge Nunc international	155409	Lot: 100808-8-0
DMEM
H–chst 33342, trihydrochloride, trihydrate (10 mg/ml solution in water, 16.2 mM solution)	Invitrogen	H3570	470519
Zeiss Apotome Axiovert 200M fluorescent microscope	Carl Zeiss, Inc.
Transpass V	New England Biolabs	M2561S	0030709
Transpass D2	New England Biolabs	M2554S	0060802
SNAP-Cell TMR Star	New England Biolabs	S9105S	0010811
pSNAP-ADBR2 Control Plasmid	New England Biolabs	N9178S	0010811
pSNAP-H2B Control Plasmid	New England Biolabs	N9179S	0010811