Summary
نحن هنا وصف بروتوكول الأساسية للصورة وتحديد توقيت الإنقسامية من الخلايا الحية الثدييات زراعة الأنسجة بعد ترنسفكأيشن سيرنا.
Abstract
ويجري تنسيق محكم التغييرات في التنظيم الخلوي الصبغي والديناميات التي تحدث أثناء الانقسام الميراث لضمان دقة المحتوى الجيني والخليوي. يمكن أن تكون السمة المميزة للأحداث الانقسام ، مثل الحركة كروموسوم ، تعقبها بسهولة على أساس الخلايا الفردية باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري مضان من خطوط الخلايا الثديية محددة معربا عن GFP الموسومة البروتينات. بالاشتراك مع رني المستندة إلى نضوب ، وهذا يمكن أن يكون وسيلة قوية للوقوف على المرحلة (ق) من حيث الانقسام العيوب تحدث بعد أن تم خفض مستويات بروتين معين. في هذا البروتوكول ، فإننا نقدم وسيلة أساسية لتقييم تأثير المواد المستنفدة بروتين الإنقسامية التنظيمية المحتملة على توقيت الانقسام. وtransfected الخلايا مع سيرنا ، وضعت في غرفة الحضانة مرحلة أعلى ، والتقط باستخدام المجهر مضان الآلي. نحن تصف كيفية استخدام البرمجيات لإقامة تجربة مرور الزمن ، وكيفية عملية تسلسل الصور لجعل إما لا تزال صورة المونتاج أو الأفلام ، وكيفية قياس وتحليل توقيت مراحل الإنقسامية باستخدام خلية خط معربا عن mCherry - الموسومة H2B هيستون. أخيرا ، نحن مناقشة اعتبارات هامة لتصميم تجربة مرور الزمن. هذه الاستراتيجية هي مكملة لنهج أخرى ، ويقدم مزايا 1) حساسية للتغيرات في الحركية التي قد لا تكون لوحظ عند النظر إلى الخلايا كما يبلغ عدد سكانها والتحليل 2) من الانقسام من دون الحاجة إلى مزامنة دورة الخلية باستخدام علاجات دوائية. المعلومات البصرية من تجارب التصوير هذه ، ليس فقط يسمح بتقييم مراحل فرعية من الانقسام ، ولكن يمكن أيضا أن توفر نظرة غير المتوقعة التي لن يكون واضحا من تحليل دورة الخلية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.
Protocol
ترنسفكأيشن سيرنا وإعداد الخلية
- 4 إعداد جيد LabTek ساترة غرف الثاني بإضافة 0.5mL من فبرونيكتين (10μg/mL) إلى كل بئر التي سيتم استخدامها. احتضان لمدة 10-15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد سيرنا / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) مجمعات للترنسفكأيشن العكسي وفقا لتعليمات الصانع ق. استخدام المبالغ الموصى بها لمدة جيدا طبق بشكل جيد في 24 دائرة لاستخدامها (100μL المجموع). يمكن أن تكون بديلا منتج مماثل / بروتوكول للترنسفكأيشن سيرنا.
- إزالة فبرونيكتين من الآبار ساترة للغرف. إضافة 100μL من سيرنا / مجمعات RNAiMAX Lipofectamine إلى كل بئر التي سيتم استخدامها.
- قسامة 20000 هيستون H2B - mCherry ، معربا عن الخلايا (في 500μL) لكل تحتوي على خليط ترنسفكأيشن جيدا.
- السماح لاحتضان خلايا لمدة 24 ساعة قبل استبدال ~ ترنسفكأيشن مع خليط من 1mL الخلية العادية المتوسطة الثقافة.
- احتضان خلايا إضافية قبل 24 ساعة من الحصول على الصور (48 ساعة بعد ترنسفكأيشن).
الإعداد المجهر والحصول على الصور
- هناك ثلاثة أجزاء رئيسية لاكتساب صورة الإعداد : 1) خلية الحاضنة التي تناسبها على المسرح المجهر ويحافظ على البيئة الرطبة ثابت من 37 درجة مئوية ، وأول أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ 2 ، 2) مجهر مقلوب مجهزة مرحلة الآلي ، الآلي ومضان brightfield مصاريع ، وعجلات تصفية الآلي ، و 3) مجموعة من البرامج التي تدمج الضوابط والمسرح ، مصاريع ، وعجلات التصفية. في الإعداد والتصوير لدينا ، ونحن نستخدم زنزانة مخصصة من مختبر الحاضنة أوكو التي يمكن استخدامها مع ساترة LabTek غرف الثانية. يتم التحكم في هذه المرحلة ، ومصاريع ، وعجلات تصفية حسب البرنامج Metamorph تلميح : المختبر أوكو مرحلة قمة النظام حاضنة تضم محولات لمجموعة متنوعة من لوحة مختلفة ، صحن ، أو أحجام ساترة.
- موقف ساترة LabTek غرف الثاني في الحاضنة عن طريق فتح غطاء الحاضنة قبل تحسنت ومعايرتها ، واضعا في غرف ساترة المحول ، وعقد في مكان مع الطين النمذجة. ترك غطاء على ساترة غرف بحيث مستنبت الخلية لن تجف. إغلاق الغطاء والحاضنة الموقف كله على المسرح المجهر ، وضمان أن يتم عقد الحاضنة ثابتا في مكانه.
- Metamorph به ، إعداد التجربة الخاصة بك عن طريق اختيار "تطبيقات / اقتناء المتعددة الأبعاد" في شريط القوائم من البرنامج. وهذا سيجلب لك نافذة يمكنك من خلاله تحديد وتيرة وطول timelapse ، ومدة التعرض لكل لون (إذا فعل إعدادات متعددة) ، وعدد وموقع من مواقع المرحلة ، وعدد من المقاطع ض (إذا ) المطلوب. . حدد مكان حفظ ملفات البيانات تلميح : في حالة استخدام برامج أخرى من Metamorph ، وظائف قد تكون مختلفة قليلا ، ولكن المفهوم العام هو نفسه. Micromanager مصدر اقتناء البرمجيات مفتوحة ImageJ مقرها متوافق مع معظم الأجهزة الاجهزة ، هو بديل ممتاز.
- . لأغراض هذا البروتوكول ، سوف نقوم الحصول على صور على اثنين من موجات (brightfield وmCherry) كل 15 دقيقة لمدة 8 ساعات في المواقف المرحلة 15 تلميح : إذا كان المطلوب هو أفضل وقت القرار ، ثم يمكنك تقصير الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ ، ولكن ويمكن استخدام عدد أقل من المناصب المرحلة ، وبالتالي أقل الخلايا الإنقسامية ستكون متاحة للتحليل. من المهم عند النظر إلى فترات زمنية تأخذ بعين الاعتبار الوقت اللازم لتصفية عجلة للتبديل بين مجموعات التصفية.
- تحديد الوقت الأمثل لتعرض كل الطول الموجي من خلال التركيز أولا على حقل من الخلايا باستخدام brightfield الإضاءة. في البرنامج ، وضبط وظيفة ضبط تلقائي للصورة فقط للقناة brightfield (وهذا سوف يسمح البرنامج لضبط تلقائي في كل موقف قبل كل مرحلة الاستحواذ) تلميح : نحن نستخدم 40X الجافة المرحلة على النقيض من الهدف لاعطاء القرار الممتاز من دون الحاجة للنفط . ويمكن استخدام الأهداف الأخرى تبعا لقرار البصرية المطلوبة.
- التبديل إلى الطول الموجي mCherry والمفاجئة صورة باستخدام التعرض مللي ثانية 50. ضبط الوقت التعرض إلى الحد الأدنى المطلوب لترى صورة جيدة. فمن الضروري تحديد مقدار التعرض للضوء لضمان استمرار بقاء الخلية. كقاعدة عامة ، يمكن أن يتحقق هذا أفضل باستخدام فلتر الكثافة محايدة (للحد من تدفق ضوء الإثارة) ، والتعرض الكاميرا وقتا أطول وليس من خلال زيادة قوة الاضاءة. كرر هذا الإجراء عن أي موجات إضافية لاستخدامها تلميح : لتحديد بقاء على الأجل الطويل في التعرض الخلية نظرا لتجربتك ، يمكنك معاينة عدد من الصور خلية يمكن البقاء على قيد الحياة على مدى timelapse المرجوة من خلال تعديل مؤقتا التباعد timepoint من دقيقة إلى ثانية (أي 10 دقيقة. تصبح 10 ثانية). إذا خلاياك البقاء التعرض 100-200 (أوالعدد المناسب) ، ثم تعرض على ما يرام. إن لم يكن ، والحد من نورك الإثارة ، ووقت التعرض ، أو العدد الكلي من الصور لمحاكاة التجربة كاملة.
- المقبل ، وحدد علامة عدد مناسب من مواقف مرحلة بحيث يمكنك تحقيق عينات كافية من السكان الخلية. سوف Metamorph تسجيل المواقف وسوف يعود هناك لاقتناء كل تلميح : عموما أنا أحاول العثور على المواقع التي يوجد الكثير من الخلايا إلى صورة ، ولكن ليست كثيرة بحيث تكون كثيفة جدا. أيضا ، فمن المهم لتحديد المواقف بما فيه الكفاية بحيث سيكون لديك فرصة جيدة لمراقبة عدد كبير من الخلايا تتقدم من خلال الانقسام.
- بعد أن تم تسجيل جميع timelapse ، والطول الموجي وقت التعرض ، ومرحلة معلومات الموقع ، حدد "معاينة" زر على الشاشة لتحديد ما إذا كان البرنامج هو السيطرة على المعدات بشكل مناسب.
- ذات مرة كنت راضيا ، حدد "الحصول على" زر على الشاشة لبدء الشراء. ثم نسترخي والسماح للكمبيوتر ومجهر للقيام بهذا العمل تلميح : لاحظ من خلال الأتمتة واحد على الأقل جولة كاملة من اقتناء لضمان أن كل شيء يعمل بشكل صحيح.
معالجة الصور وتحليلها
- بعد انتهاء عملية الاستحواذ ، فإن الخطوة التالية هي لنقل بيانات الصورة إلى شكل يمكن أن يكون أسهل في التعامل معها. لأغراض هذا البروتوكول ، وسوف يثبت أولا كيفية إنشاء الأفلام باستخدام Metamorph ، ثم كيفية توليد صورة مركبة باستخدام برنامج ImageJ. فإما أن يكون مفيدا تنسيق لأغراض القياس الكمي.
- الخطوة الأولى هي مراجعة البيانات. للقيام بذلك ، حدد "تطبيقات / مراجعة بيانات متعددة الأبعاد" في شريط القائمة. حدد موقع الملفات الخاصة بك ، ثم اختر "عرض". هذا سيسمح لك لاستعراض كومة من الصور من كل مرحلة على حدة الموقف. حدد موقف المرحلة المطلوب ، ثم "تحميل الصور". سوف تكون قادرة على النهوض من خلال بيانات الإطار حسب الإطار.
- لتلك المناصب المرحلة التي تمر خلايا الانقسام (على النحو الذي يحدده كل من الحمض النووي والتشكل الخلوي) ، يمكنك صنع أفلام والمونتاج باستخدام Metamorph ، أو مع برامج أخرى مثل ImageJ (متوفرة مجانا من خلال المعاهد الوطنية للصحة).
- لجعل الفيلم في Metamorph ، حدد "عملية / حفظ الفيلم" في شريط القائمة. هل سيكون قادرا على تحديد الأطر التي الاستخدام ، والسرعة ، ونوع ملف الفيلم. ثم حدد "حفظ الفيلم".
- لإجراء المونتاج ، وأنا كومة حفظ الصور كملف STK. ، والتي يمكن استخدامها في برامج أخرى مثل ImageJ.
- فتح الملف في ImageJ وتطوير الأطر حتى تجد خلية يمر الانقسام. . محصول محيط الخلية وحدد "صورة / مكرر" تلميح : تأكد لجميع الأطر مكررة.
- لإجراء المونتاج ، حدد "صورة / الأكوام / اصنع مونتاج" في شريط القائمة. هنا يمكنك تحديد الأطر التي تريد تضمينها ، وحجم وشكل المونتاج ، وإذا كنت تريد الحدود بين الإطارات. حدد هذه وضرب "حسنا". . المونتاج حفظ كملف TIF والقيام بأي مزيد من المعالجة إما في ImageJ أو أدوبي فوتوشوب تلميح : تغيير الملفات المونتاج من تنسيق 16 بت المستخدمة من قبل Metamorph إلى 8 بت صيغة لمعالجة الصور أسهل.
- لحساب الوقت في مراحل مختلفة من الانقسام ، وتحديد ر = 0 (أول بادرة من التكثيف الحمض النووي أو التقريب الخلية) ، حساب عدد من الإطارات حتى تتماشى الكروموسومات عند خط الاستواء (التوقيت في الطور الأول / طليعة الطور) ، إطارات حتى تبدأ لفصل الصبغيات (الكروموسومات) (التوقيت في الطورية) ، والإطارات حتى تبدأ الخلايا لتتسطح (طور الصعود / الطور النهائي / الحرائك الخلوية). الوقت محسوب في كل مرحلة الإنقسامية يعتمد على الفاصل الزمني بين كل إطار.
ممثل النتائج
الشكل 1 يوضح النتائج من تجربة نموذجية تحكم ترنسفكأيشن باستخدام خط سيرنا الخلية هيلا معربا عن هيستون H2B - mCherry. وقد استخدمت هذه الطريقة في تحديد توقيت بفعالية الإنقسامية ، وكشف عن دور غير متوقعة للNup153 nucleoporin في توقيت متأخر الانقسام 1. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الرقم 1.
Discussion
مع التطورات الحديثة في مجال التصوير والتكنولوجيا بروتين فلوري ، أصبح التصوير يعيش الجانب الروتيني للتحليل الخلوي 2. مجموعة متنوعة من GFP (ومتغيرات الألوان الأخرى 3) الموسومة البروتينات متوفرة على نطاق واسع أو سهلة نسبيا لبناء ويمكن استخدامها لتعقب عدد من بصمات انقسام الخلايا بما في ذلك الحمض النووي / ديناميات كروموسوم 4 و 5 و 6 ازدواجية الجسيم المركزي ، cyclin B ديناميات 7 ، وانهيار المغلف النووية وإعادة التجميع 8 ، 9 ، 10 الإنقسامية تشكيل المغزل ، ومراحل مختلفة من الحرائك الخلوية 11. ويمكن استخدام البروتينات الموسومة بمفرده أو بالاشتراك عند الأطياف الإثارة / انبعاث به نيون متوافقة ، مما يسمح بتقييم التنسيق بين أحداث معينة. إذا كان قرار زيادة المكانية و / أو الزمان هو / هي المطلوبة ، سواء المجهري متحد البؤر المسح الضوئي ويمكن استخدام الليزر ، وقرص الغزل ، أو بالرنين المسح الضوئي ، وقائمة من الخيارات المجهري متطورة مع التزايد المستمر القرار ما زال ينمو. كما تم تصوير حي لالانقسام في الخلايا الثديية تكييفها للاستخدام في الإنتاجية العالية ورني شاشات جزيء صغير 12-14. وهكذا ، بينما التجارب الأولية ليالي one باستخدام هذه التقنية قد تكون بسيطة نسبيا ، وإمكانيات بناء على هذه الاستراتيجية هي واسعة النطاق.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الأميركية للسرطان (PF - 07 - 103 - 01 - CSM) ، والمعاهد الوطنية للصحة (R01 GM61275 وCA042014 P30) ، وسرطان الدم والغدد اللمفاوية المجتمع ، ومؤسسة هنتسمان للسرطان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
- Mackay, D. R., Elgort, S. W., Ullman, K. S. The nucleoporin Nup153 has separable roles in both early mitotic progression and the resolution of mitosis. Mol Biol Cell. 20, 1652-1660 (2009).
- Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Meraldi, P., Draviam, V. M., Sorger, P. K. Timing and checkpoints in the regulation of mitotic progression. Dev Cell. 7, 45-60 (2004).
- Mora-Bermudez, F., Ellenberg, J. Measuring structural dynamics of chromosomes in living cells by fluorescence microscopy. Methods. 41, 158-167 (2007).
- Prosser, S. L., Fry, A. M. Fluorescence imaging of the centrosome cycle in mammalian cells. Methods Mol Biol. 545, 165-183 (2009).
- Malureanu, L. A. BubR1 N terminus acts as a soluble inhibitor of cyclin B degradation by APC/C(Cdc20) in interphase. Dev Cell. 16, 118-131 (2009).
- Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Reshaping of the endoplasmic reticulum limits the rate for nuclear envelope formation. J Cell Biol. 182, 911-924 (2008).
- Beaudouin, J., Gerlich, D., Daigle, N., Eils, R., Ellenberg, J. Nuclear envelope breakdown proceeds by microtubule-induced tearing of the lamina. Cell. 108, 83-96 (2002).
- Marcus, A. I. Visualization of spindle behavior using confocal microscopy. Methods Mol Med. 137, 125-137 (2007).
- Steigemann, P. Aurora B-mediated abscission checkpoint protects against tetraploidization. Cell. 136, 473-484 (2009).
- Draviam, V. M. A functional genomic screen identifies a role for TAO1 kinase in spindle-checkpoint signalling. Nat Cell Biol. 9, 556-564 (2007).
- Neumann, B. High-throughput RNAi screening by time-lapse imaging of live human cells. Nat Methods. 3, 385-390 (2006).
- Stegmeier, F. Anaphase initiation is regulated by antagonistic ubiquitination and deubiquitination activities. Nature. 446, 876-881 (2007).
