Summary
Nous décrivons ici un protocole de base pour l'image et de quantifier le timing mitotique des mammifères vivent cellules de culture tissulaire après transfection de siRNA.
Abstract
Les changements dans l'organisation cellulaire et de la dynamique des chromosomes qui se produisent pendant la mitose sont étroitement coordonnés afin d'assurer l'héritage précise du contenu génomique et cellulaire. Hallmark évènements de la mitose, comme le mouvement des chromosomes, peuvent être facilement suivis sur une base en utilisant des cellules individuelles time-lapse de microscopie par fluorescence des lignées cellulaires de mammifères exprimant des protéines GFP-marqués. En combinaison avec l'ARNi basée sur l'épuisement, cela peut être une méthode puissante pour repérer le stade (s) de la mitose où les défauts se produisent après les niveaux d'une protéine particulière ont été abaissés. Dans ce protocole, nous présentons une méthode de base pour évaluer l'effet d'appauvrir une protéine mitotique réglementaires potentielles sur le moment de la mitose. Les cellules sont transfectées avec le siRNA, placé dans une chambre d'incubation étape-top, et imagée en utilisant un microscope à fluorescence automatisées. Nous décrivons comment utiliser le logiciel pour mettre en place une expérimentation time-lapse, la façon de traiter les séquences d'images à faire ou bien encore l'image des montages ou des films, et la façon de quantifier et d'analyser le calendrier des étapes de la mitose en utilisant une lignée cellulaire exprimant mCherry- taggés histone H2B. Enfin, nous discuterons des considérations importantes pour la conception d'une expérience de time-lapse. Cette stratégie est complémentaire à d'autres approches et offre les avantages de 1) la sensibilité aux variations de la cinétique qui pourraient ne pas être observé quand on regarde les cellules en tant que population et 2) l'analyse de la mitose, sans la nécessité de synchroniser le cycle cellulaire en utilisant des traitements médicamenteux. L'information visuelle à partir des expériences d'imagerie telles permet non seulement les étapes de la mitose sous-être évalué, mais il peut également donner un aperçu inattendu qui ne serait pas apparente de l'analyse du cycle cellulaire par FACS.
Protocol
transfection de siRNA et de préparation de cellules
- Préparer un 4-II ainsi LabTek chambrée lamelle en ajoutant 0,5 mL de la fibronectine (10μg/mL) dans chaque puits qui seront utilisées. Incuber pendant 10-15 minutes à température ambiante.
- Préparer siARN / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) pour la transfection des complexes inverse selon les instructions du fabricant. Utiliser les quantités recommandées pour l'un et d'un plat de 24 puits par chambre pour être utilisés (100 ul au total). Un produit analogue / protocole pour la transfection de siRNA peuvent être substitués.
- Retirez la fibronectine à partir des puits de la lamelle chambrée. Ajouter 100 pi de siRNA / Lipofectamine complexes RNAiMAX dans chaque puits qui seront utilisées.
- Aliquoter 20000 histone H2B-mCherry cellules exprimant (en 500μL) par puits contenant le mélange de transfection.
- Laisser les cellules à incuber pendant environ 24 heures avant de replacer le mélange de transfection avec 1 ml de milieu de culture cellulaire régulier.
- Incuber les cellules 24 heures supplémentaires avant d'acquisition d'image (48 heures post-transfection).
Configuration de microscope et d'acquisition d'image
- Il ya trois parties principales de la configuration d'acquisition d'image: 1) une cellule d'incubation qui s'adapte sur la platine du microscope et maintient un milieu humide, constante de 37 ° C et 5% de CO 2, 2) d'un microscope inversé équipé d'une étape automatisée, automatisé volets fluorescence et clair, et les roues à filtres automatiques et 3) un logiciel qui intègre et contrôle la scène, des volets, et roues à filtres. Dans notre configuration d'imagerie, nous utilisons une cellule personnalisée incubateur d'OKO Lab qui peut être utilisé avec la lamelle LabTek II chambrée. La scène, volets, et roues à filtres sont contrôlés par le logiciel Metamorph Astuce:. Le Laboratoire OKO scène dessus du système incubateur comprend des adaptateurs pour une variété de différentes plaques, vaisselle, ou des tailles lamelle.
- Placez le LabTek II chambrée lamelle dans l'incubateur en ouvrant le couvercle de la pré-chauffé et équilibrée incubateur, plaçant le lamelle chambrée dans l'adaptateur, et la tenue en place avec la pâte à modeler. Laissez le couvercle sur la lamelle chambré pour que le milieu de culture cellulaire ne se dessèche pas. Fermer le couvercle et la position de l'ensemble incubateur sur la platine du microscope, veillant à ce que la couveuse est maintenu fermement en place.
- Utiliser Metamorph, configurer votre expérience en sélectionnant "Apps / Acquisition multidimensionnelle» dans la barre de menu du logiciel. Cela fera apparaître une fenêtre dans laquelle vous pouvez sélectionner la fréquence et la longueur de la timelapse, le temps d'exposition pour chaque couleur (si vous faites les réglages multiples), le nombre et l'emplacement des postes de scène, et le nombre de Z-sections (si ) désiré. . Sélectionnez l'emplacement où enregistrer les fichiers de données Astuce: Si vous utilisez un logiciel autre que Metamorph, les fonctions peuvent être légèrement différentes, mais le concept général est le même. Microgestionnaire, les logiciels open source d'acquisition basée sur ImageJ qui est compatible avec la plupart des configurations matérielles, est une excellente alternative.
- . Pour les fins du présent protocole, nous allons acquérir des images à deux longueurs d'onde (clair et mCherry) toutes les 15 minutes pendant 8 heures à 15 postes étape Astuce: Si la résolution de meilleur moment est désirée, alors vous pouvez raccourcir l'intervalle de temps entre les acquisitions, mais , les positions étape de moins peuvent être utilisés, et donc moins de cellules mitotiques sera disponible pour analyse. Il est important lorsque l'on considère des intervalles de temps pour prendre en compte le temps nécessaire pour que la roue de filtres pour basculer entre les ensembles de filtres.
- Déterminer le temps d'exposition optimal pour chaque longueur d'onde d'abord se concentrer sur un champ de cellules en utilisant un éclairage fond clair. Dans le logiciel, réglez la fonction autofocus uniquement pour le canal clair (cela va permettre au logiciel de mise au point automatique à chaque position étape avant chaque acquisition). Conseil: Nous utilisons un sèche 40x à contraste de phase pour objectif de donner une excellente résolution sans la nécessité pour le pétrole . D'autres objectifs peuvent être utilisés en fonction de la résolution optique désirée.
- Passez à l'onde mCherry et enclenchez une image en utilisant une exposition de 50 ms. Réglez le temps d'exposition au minimum requis pour voir une bonne image. Il est essentiel de limiter la quantité d'exposition à la lumière pour assurer la viabilité cellulaire soutenue. En règle générale, cela peut être mieux réalisé en utilisant un filtre de densité neutre (pour réduire le flux lumineux d'excitation) et un temps plus long appareil d'exposition, plutôt que par augmentation de la force d'illumination. Répétez cette procédure pour tous les longueurs d'onde supplémentaires à utiliser. Conseil: Pour déterminer la viabilité cellulaire à long terme à une exposition donnée pour votre expérience, vous pouvez prévisualiser le nombre total d'images d'une cellule peut survivre sur le timelapse désiré en ajustant temporairement l'espacement timepoint de quelques minutes à quelques secondes (soit 10 min. devient 10 secondes). Si vos cellules survivent 100-200 expositions (ou lenombre approprié), puis votre exposition est très bien. Si non, à réduire votre lumière d'excitation, le temps d'exposition, ou le nombre total d'images pour simuler votre expérience complète.
- Ensuite, sélectionner et marquer un nombre approprié de postes stade de sorte que vous pouvez obtenir un échantillonnage suffisant de la population cellulaire. Metamorph va enregistrer les positions et y retournera pour chaque acquisition. Conseil: En général, je essayer de trouver des positions dans lesquelles il ya beaucoup de cellules à l'image, mais pas si nombreux qu'ils sont trop denses. Aussi, il est important de sélectionner suffisamment de postes de telle sorte que vous aurez une bonne chance d'observer un grand nombre de cellules progressant à travers la mitose.
- Après tout Timelapse, temps d'exposition de longueur d'onde, et les informations de position étape ont été enregistrés, sélectionnez le bouton "Aperçu" sur l'écran pour déterminer si le logiciel est de contrôler l'équipement de façon appropriée.
- Lorsque vous êtes satisfait, sélectionnez le bouton "Acquérir" sur l'écran pour commencer l'acquisition. Alors asseyez vous et laissez l'ordinateur et d'un microscope pour faire le travail. Conseil: Respectez l'automatisation à travers au moins une manche complète de l'acquisition pour s'assurer que tout fonctionne correctement.
De traitement et analyse d'images
- Après l'acquisition est terminée, la prochaine étape est de transférer les données d'image dans une forme qui est facile à manipuler. Pour les fins du présent protocole, je vais d'abord démontrer la façon de générer des films en utilisant Metamorph, puis la façon de générer des montages d'images en utilisant le programme ImageJ. Soit le format sera utile à des fins de quantification.
- La première étape consiste à examiner les données. Pour ce faire, sélectionnez "Apps / Revue données multidimensionnelles" dans la barre de menu. Sélectionnez l'emplacement de vos fichiers, puis sélectionnez «Affichage». Cela vous permettra d'examiner la pile d'images de chaque position étape individuellement. Sélectionnez la position de l'étape désirée, puis "Charger les images". Vous serez en mesure d'avancer à travers les données de trame par trame.
- Pour ces postes étape dans laquelle les cellules passent par mitose (tel que déterminé par l'ADN et la morphologie cellulaire), vous pouvez faire des films et montages utilisant Metamorph, ou avec d'autres programmes tels que ImageJ (disponible gratuitement grâce NIH).
- Pour faire un film dans Metamorph, sélectionnez «Processus / Save film" dans la barre de menu. Vous serez en mesure de sélectionner les cadres à utiliser, la vitesse et le type de fichier du film. Ensuite, sélectionnez "Enregistrer le film".
- Pour faire un montage, je sauve la pile d'image comme un fichier. Stk, qui peut être utilisé dans d'autres programmes tels que ImageJ.
- Ouvrez le fichier dans ImageJ et de faire progresser les cadres jusqu'à trouver une cellule en passant par la mitose. . Cultures de la zone autour de la cellule et sélectionnez "Image / Dupliquer" Astuce: Assurez-vous de dupliquer tous les cadres.
- Pour faire un montage, sélectionner "Image / Piles / Faire Montage" dans la barre de menu. Ici vous pouvez spécifier les images que vous souhaitez inclure, la taille et la forme du montage, et si vous voulez les frontières entre les cadres. Sélectionnez celles-ci et cliquez sur "Ok". .. Enregistrer le montage dans un fichier TIF et tout autre traitement ne soit dans ImageJ ou Adobe Photoshop Astuce: Changer le montage des fichiers du format 16-bit utilisé par Metamorph au format 8 bits pour le traitement de l'image plus facile.
- Pour calculer le temps à différentes étapes de la mitose, déterminer t = 0 (premier signe de condensation ADN ou l'arrondissement des cellules), compter le nombre d'images jusqu'au chromosomes sont alignés à l'équateur (heure en prophase / prométaphase), les cadres jusqu'au chromosomes commencent à séparer les (temps en métaphase), et les cadres jusqu'à ce que les cellules commencent à s'aplatir (anaphase / télophase / cytokinèse). Le temps calculé à chaque étape mitotique dépend de l'intervalle de temps entre chaque image.
Les résultats représentatifs
La figure 1 illustre les résultats d'une expérience de transfection de siRNA contrôle typique utilisant une lignée cellulaire HeLa exprimant histone H2B-mCherry. Cette méthode a été utilisée de manière efficace afin de quantifier le calendrier mitotique, révélant un rôle inattendu pour le Nup153 nucléoporine dans le calendrier de la fin de la mitose 1. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version agrandie de la figure 1.
Discussion
Avec les progrès récents de l'imagerie et la technologie des protéines fluorescentes, imagerie en temps réel est devenue un aspect de routine de l'analyse cellulaire 2. Une variété de la GFP (et des variantes de couleur autre 3)-protéines étiquetées sont largement disponibles ou relativement faciles à construire et peuvent être utilisés pour suivre un certain nombre de caractéristiques, y compris la division cellulaire ADN / chromosomes dynamiques 4, 5, 6 duplication du centrosome, la cycline B dynamiques 7, la répartition de l'enveloppe nucléaire et le remontage 8, 9, la formation du fuseau mitotique 10, et les différentes étapes de la cytokinèse 11. Tagged protéines peuvent être utilisées seules ou en combinaison lorsque les spectres d'excitation / émission de marqueurs fluorescents sont compatibles, permettant la coordination entre les événements spécifiques à évaluer. Si une plus grande résolution spatiale et / ou temporelle est / sont souhaités, la microscopie confocale à balayage laser à balayage si, le disque tourne, ou la résonance peut être utilisé, et la liste des options de microscopie sophistiquées avec de plus en plus la résolution continue de croître. Imagerie en direct de la mitose des cellules de mammifères a également été adapté pour une utilisation à haut débit ARNi et des écrans de petites molécules 12-14. Ainsi, alors que les premières expériences un s en utilisant cette technique peut être relativement simple, les possibilités de renforcer cette stratégie sont nombreuses.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'American Cancer Society (PF-07-103-01-CSM), le National Institutes of Health (R01 et P30 CA042014 GM61275), la Leukemia and Lymphoma Society et le Huntsman Cancer Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-075 | |
| Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 12-565-337 | Additional chamber sizes are available |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Stage-top cell incubator | OKO Lab | Can use any appropriate chamber | |
| Automated inverted fluorescence microscope | Olympus Corporation | Can use any appropriate microscope | |
| Software package | Metamorph | Can use any appropriate software |
References
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