Summary
هذا الفيديو يوضح التقنية المستخدمة لإعداد منظم وexplants قطب من أجنة الحيوانات القيطم المورق ، بما في ذلك استخدام السكين الحاجب -- أداة تشريح المتخصصة مصنوعة من الحاجب واحد. ويرد أيضا على بروتوكول لتجميع an مقايسة الالتصاق ، والتي تحقيقات عن وجود جزيئات الالتصاق الرئيسية موجودة على سطح منظم أو خلايا القطب الحيوانية التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق التنمية السليمة.
Protocol
تستعد الدوائر الالتصاق (قبل يوم من الحقن / تشريح)
غرف الفحص التصاق
إذا كان لديك مجهر مركب تقليدي (بصري يقع فوق خشبة المسرح) ، فمن ncecessary لجعل منخفضة الارتفاع التصاق الغرفة على النحو التالي. إذا باستخدام المجهر المقلوب البصرية ، ثم "نونك ساترة يحتل هيئة تشريعية لاب تيك" يمكن أن يكون مجرد استخدامها ، وتخطي الخطوات # 1 -- 2.
- تعلق واحدة من "الصحافة لختم عازل السيليكون" على تغطية زلة × 40 24MM. اضغط بقوة عازل للتغطية على زلة الفوق نظيفة وتبدو من الجانب الآخر للتأكد من أن يتم إرفاق عازل تماما دون أي فقاعات الهواء.
- اختياري : ضع الدوائر التصاق في طبق بتري الزجاج مع الورق Whatman تصفية وتعقيم في دورة جافة لتعقيم. تبريدها وصولا الى RT.
طلاء الغرفة
- وضع قطرات 200ml العمل حل كادهيرين (10mg/ml) أو فبرونيكتين (20mg/ml) على مركز للغرفة التصاق تعقيمها ، وذلك باستخدام نصائح sigmacoated الصفراء. RT في احتضان لمدة 4 ساعات.
- إخراج الحل كادهيرين أو فبرونيكتين ونقل إلى أنبوب 1.5ml. ويمكن استخدامها لهذا الحل خلال الاسبوعين المقبلين.
- 500ml من الاستغناء عن 4 ٪ في جيش صرب البوسنة 1X MBS - H لعرقلة الغرفة. RT في احتضان لمدة 1 ساعة.
- نضح حل جيش صرب البوسنة. غسل الغرفة مع 500ml من 1X H - MBS مرتين. بعد غسل الثاني ، نضح معظم H - MBS (ليس تماما) ، وتخزينها في حاوية مغلقة عند 4 درجة مئوية. التصاق هذه القاعة هو جيد لل2 التالي -- 3 أيام.
تشريح وتفكك Explants رسملة الحيوان
- احتضان هذه الأجنة المحقونة في 0.1x H - MBS ، مخففة من 1X تعقيمها MBS - H ، وعدم تعقيمها المتوسطة يحمل الجراثيم في وقت ما القليل الذي يمكن ان يؤثر على الغطاء الحيواني فصل الخلايا.
- جعل 1X بارت في لوحات وagarose CMF - MBS وحات agarose مع أطباق 60mm ، على الأقل فيما يصل عدد العينات الخاصة بك. صب تعقيمها 1X MBS - H لوحات 1X لبارت. لوحات CMF - MBS ، صب 10ML من CMF - MBS.
- عندما تصبح أجنة المرحلة 8.5 ، بدء تشريح الحيوانات في مباراة صحن 1X لبارت. 10-15 explants في عينات وعادة ما تكون كافية للتجربة.
- نقل الحيوانات explants غطاء لوحة CMF - MBS. لاحتضان explants لمدة 45 -- 60 دقيقة حتى يتم فصلها تماما explants. والثورات لطيف في كل 15 دقيقة تساعد التفكك.
خلية التصاق الفحص
- بذر الخلايا : الاستغناء 500ml من 1X MBS - H إلى غرفة التصاق أعد الخطوات في المقاطع المذكورة أعلاه ، وغرف الفحص والتصاق طلاء الغرفة. نقل سقف فصل الخلايا الحيوانية من لوحة CMF - MBS إلى غرفة الالتصاق به P200 مع نصائح أصفر sigmacoated وقطعوا.
- اختياري : إذا كان ممكنا ، تمتص بعناية والمتوسطة حتى ما يقرب من 2 / 3 في منتصف الطريق ، من دون تعريض الخلايا إلى الهواء. إضافة ما يقرب من نفس الكمية من جديد MBS - H ، للتأكد من أنه يحتوي على الكالسيوم وسيلة كافية 2 + 2 + والمغنيسيوم.
- في لاحتضان RT 45-90 دقيقة. فحص الخلايا في بعض الأحيان لمعرفة ما اذا كانوا المترتبة على السطح السفلي.
- الآن يمكنك أن تأخذ صورة من الخلايا تحت المجهر.
- وضعت الغرفة على شبكة التصاق الزجاج الشريحة. محاذاة واحدة من زوايا الغرفة الانضمام الى ركلة ركنية من الشريحة الشبكة. عد وتسجيل عدد من الخلايا في شبكات المرفقة مختلفة.
- صب 1L من H - MBS في دلو من البلاستيك كبيرة (على سبيل المثال ، تثبرور ، الخ). وضعت الغرفة الشريحة بلطف الانضمام إلى الجزء السفلي من دلو. تناوب عليها على مدار شاكر لمدة خمس دقائق على سرعة منخفضة (50 -- 60rpm).
- وضعت الغرفة التصاق الظهر على الشريحة الشبكة ، محاذاة الزاوية نفسها من الغرفة إلى الزاوية نفسها من الشريحة الشبكة ، كما فعل في الخطوة # 5 من هذا الباب ، خلية التصاق الفحص. حساب عدد الخلايا التي لا تزال تعلق على الشبكة نفسها التي لديك حساب قبل الغسيل. حساب النسبة المئوية من الخلايا التي لا تزال تعلق بعد الغسيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x MBS-H | Buffer | Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
| CMF-MBS | Buffer | This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave. | ||
| 1% agarose/1x Barth’s plates | as many as the number of samples | |||
| 1% agarose/CMF-MBS plates | as many as the number of samples | |||
| E-Cadherin/Fc chimera | Reagent | Sigma-Aldrich | E-2278 | Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution. |
| Fibronectin, 0.1% solution | Reagent | Sigma-Aldrich | F-1141 | This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results. |
| 4% BSA /MBS-H | Buffer | BSA: molecular biology grade fraction V | ||
| Sigmacoted yellow tips | Tool | |||
| No.1 cover slips | 40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm | |||
| Press-to-seal silicon insulator | Tool | Glace Bio-Labs | JTR20-2.5 | 2.5 mm depth x 20 mm diameter |
| NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass | Tool | Fisher Scientific | 12-565-471 | 2 wells/slides |
| Grid slide glass | Tool | or Finder graticule for cell counting |
