Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay

doi: 10.3791/187 Published: April 29, 2007

Summary

Deze video toont de techniek die gebruikt wordt voor de voorbereiding van organisator en dier pole explantaten van Xenopus laevis embryo's, waaronder het gebruik van de wenkbrauw mes - een speciale tool gemaakt dissectie van je wenkbrauw. Het protocol voor het monteren van een adhesie-test wordt ook gegeven, die probes voor de aanwezigheid van belangrijke adhesiemoleculen op het oppervlak aanwezig organisator of dierlijke paal cellen die essentieel zijn voor een goede ontwikkeling.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Voorbereiden Hechting Chambers (de dag vóór de injectie / dissectie)

Hechting Assay Chambers

Als u een conventionele samengestelde microscoop (optische lokaliseert boven het podium), is het ncecessary om een ​​lage hoogte hechting kamer als volgt. Bij gebruik van de omgekeerde-optiek microscoop, dan "NUNC Lab-Tek Chambered dekglaasje" kan gewoon worden gebruikt, en sla de stappen # 1 - 2.

  1. Bevestig een van de "pers-to-seal silicium isolator" op een 40 x 24 mm dekglas. Druk stevig op de isolator om de dekglas op schone werkblad en zie van de andere kant om ervoor te zorgen dat de isolator geheel is bevestigd zonder luchtbellen.

  2. Optioneel: Doe de hechting kamers in een glazen petrischaal met een Whatman filter papier en autoclaaf in droge-cyclus te steriliseren. Cool hen naar RT.

Coaten van de Kamer

  1. Doe een 200ml druppel van de werkoplossing van cadherine (10mg/ml) of met fibronectine (20mg/ml) op het midden van een autoclaaf hechting kamer, met behulp van sigmacoated geel tips. Incubeer bij RT gedurende 4 uur.

  2. Haal de cadherine of met fibronectine oplossing en transfer naar een 1,5 ml buis. Deze oplossing kan worden hergebruikt voor de komende twee weken.

  3. Doseer 500 ml van 4% BSA in 1x MBS-H naar de kamer te blokkeren. Incubeer bij RT gedurende 1 uur.

  4. Zuig het BSA-oplossing. Was de kamer met 500ml 1x MBS-H twee keer. Na de tweede wasbeurt, zuigen de meeste van de MBS-H (niet volledig), en op te slaan in een gesloten verpakking bij 4 º C. Deze hechting kamer is goed voor de komende 2 - 3 dagen.

Dissectie en dissociatie van Animal Cap Explantaten

  1. Incubeer de geïnjecteerde embryo's in 0.1x MBS-H, verdund van de geautoclaveerde 1x MBS-H, als niet-geautoclaveerde medium ergens draagt ​​weinig kiemen die kunnen verstoren de gedissocieerde dier dop cellen.

  2. Maak 1x Barth's agarose platen en CMF-MBS agarose platen met 60mm gerechten, minstens evenveel als het aantal van uw monsters. Giet geautoclaveerd 1x MBS-H in 1x Barth's platen. Voor de CMF-MBS borden, giet er 10 ml van de CMF-MBS.

  3. Als de embryo's worden stadium 8,5, start het ontleden van het dier caps in de plaat een 1x Barth's. 10 tot 15 explantaten per monsters zijn meestal genoeg voor een experiment.

  4. Breng het dier dop explantaten naar een CMF-MBS plaat. Incubeer de explantaten voor 45 - 60 minuten tot de explantaten zijn volledig gescheiden. Gentle gemoedsbewegingen in om de 15 minuten zal helpen de dissociatie.

Celadhesie Assay

  1. Zaaien van de cellen: Doseer 500ml 1x MBS-H om de hechting kamer bereid in de stappen in de bovenstaande punten, Adhesie Assay Chambers en Coating de Kamer. Breng de gedissocieerde dier dop cellen van de CMF-MBS plaat om de hechting kamer met behulp van P200 met een sigmacoated en gehakte-off geel tips.

  2. Optioneel: Indien mogelijk, voorzichtig zuigen het medium tot ongeveer 2 / 3 tot de helft, zonder bloot cellen aan de lucht. Voeg ongeveer dezelfde hoeveelheid verse MBS-H, om ervoor te zorgen dat het medium voldoende Ca 2 + bevat en Mg 2 +.

  3. Incubeer bij RT voor 45 - 90 minuten. Kijk dus regelmatig op de cellen te zien of ze zijn verbonden aan de onderkant.

  4. Nu kunt u het beeld van de cellen onder een microscoop.

  5. Zet de hechting kamer op een rooster slide glas. Breng een van de hoeken van de hechting kamer naar een hoek van het raster dia. Tel en noteer het nummer van het bijgevoegde cellen in verschillende netten.

  6. Giet 1L van MBS-H in een grote plastic emmer (bijv. Tupperware, etc.). Voorzichtig de hechting slide kamer te maken aan de bodem van de emmer. Draai het op de orbitale schudder gedurende vijf minuten bij lage snelheid (50 - 60rpm).

  7. Leg de hechting kamer op de grid schuift, het afstemmen van de dezelfde hoek van de kamer naar dezelfde hoek van het raster glijbaan, zoals werd gedaan in stap # 5 van deze sectie, Celadhesie Assay. Tel het aantal cellen die verbonden blijven op hetzelfde rooster die je hebt geteld voordat het wasgoed. Bereken het percentage van cellen die bevestigd blijft na het wassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1x MBS-H Buffer Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS Buffer This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera Reagent Sigma-Aldrich E-2278 Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution Reagent Sigma-Aldrich F-1141 This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H Buffer BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips Tool
No.1 cover slips 40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator Tool Glace Bio-Labs JTR20-2.5 2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass Tool Fisher Scientific 12-565-471 2 wells/slides
Grid slide glass Tool or Finder graticule for cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Ontleding van Organisator en dierlijke Pole Explantaten van Xenopus laevis embryo's en montage van een Celadhesie Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).More

Ogata, S., Cho, K. W. Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay. J. Vis. Exp. (3), e187, doi:10.3791/187 (2007).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter