Biology

주최자 및 동물 폴 Explants Xenopus laevis의 태아로부터 세포 접착 분석의 총회의 해부

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/187

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

자기 눈썹 만든 전문 해부 도구 -이 비디오는 눈썹 나이프의 사용을 포함하여 Xenopus laevis의 배아에서 주최 및 동물 극 explants의 준비에 사용되는 기술을 설명합니다. 유착 분석을 조립을위한 프로토콜은 또한 주요 유착 분자의 존재에 대한 프로브가 표면 주최자 또는 적절한 개발을위한 중요 동물 극 세포에 존재하는, 주어진 것입니다.

Protocol

접착 챔버스 준비 (전날 사출 / 절개)

접착 분석 챔버스

당신은 종래의 복합 현미경 (무대 위 광학 찾아)이있다면, 그것은 낮은 높이 접착력 챔버는 다음과 같이 할 ncecessary입니다. 거꾸로 - 광학 현미경을 사용하는 경우, "NUNC 연구소 - 테크 Chambered의 Coverglass은"단지 사용하고, 단계 # 1 생략 수 있습니다 - 2.

40 X 24mm 커버 슬립에 "언론 - 투 - 밀봉 실리콘 절연체"중 하나를 첨부합니다. 단단히 깨끗한 benchtop에서 커버 슬립에 절연체를 눌러 절연체가 완전히 다른 공기 방울없이 연결되었는지 확인하기 위해 반대편에서보세요.
선택 사항 : 소독하기 위해 드라이주기 왓먼 필터 종이 압력솥과 유리 페트리 접시에 부착 실 놔. RT에게 시원한 시간을 보내세요.

코팅 상공 회의소

sigmacoated 노란색 도움말을 사용하여 autoclaved 부착 챔버의 중심에 cadherin (10mg/ml) 또는 fibronectin (20mg/ml)의 솔루션을 작업의 200ml 비말 놔. 4 시간 RT에서 알을 품다.
cadherin이나 fibronectin 솔루션을 꺼내서하고 1.5ml 튜브에 전송할 수 있습니다. 이 솔루션은 다음 두 주 동안 활용할 수 있습니다.
챔버를 차단하기 위해 MBS - H 1X의 4 % BSA의 500ml 분배. 1 시간 RT에서 알을 품다.
BSA 솔루션을 대기음. 두번 1X MBS - H의 500ml와 챔버를 씻으십시오. 두 번째 세척 후, (아니 완전히) MBS - H의 대부분을 기음, 4 º C.에서 밀폐된 용기에 보관 삼일 -이 유착 챔버은 다음 2 좋습니다.

해부와 동물 캡 Explants의 해리

비 - autoclaved 매체 언젠가 dissociated 동물 캡 세포를 방해있는 작은 세균을 지니고 있듯이, autoclaved 1X MBS - H에서 희석 0.1x MBS - H에 주입된 배아를 품어.
귀하의 샘플의 번호로 적어도 많은, 60mm 요리 1X 바쓰의 아가로 오스 접시와 CMF - MBS 아가로 오스의 번호판을 확인합니다. 1X 바쓰의 접시에 autoclaved 1X MBS - H 하거라. CMF - MBS 접시 들어, CMF - MBS의 10ml를 부어.
배아가 무대 8.5이 될 때, 1X 바쓰의 접시에서 동물 모자를 해부 시작합니다. 10 - 샘플 당 15 explants은 실험을 위해 일반적으로 충분합니다.
CMF - MBS 판에 동물 캡 explants을 전송합니다. explants가 완전히 dissociated까지 60분 - 45 explants을 품어. 매 15 분 후에 부드러운 agitations은 분리 도움이 될 것입니다.

세포 접착 분석

세포를 심는 것은 : 위의 섹션, 접착 분석 챔버 및 코팅 회의소의 단계에서 준비한 부착 실로 1X MBS - H의 500ml 분배. CMF - MBS 판에서 sigmacoated와 다진 - 오프 노란색 팁을 P200을 사용하여 부착 챔버에 dissociated 동물 캡 세포를 전송합니다.
선택 사항 : 가능하면 신중하게 공기에 세포를 노출하지 않고 약 삼분의이 중간에하는 매체를 빨아. 거의 같은 매체가 충분한 ^{칼슘이 포함되어} 있는지 확인하기 위해 신선한 금액 MBS - H, ^+와 MG ^{2 +.} 추가
90분 - 45 RT에서 알을 품다. 그들은 바닥의 표면에 부착하고 있는지 때때로 세포를 확인합니다.
지금 당신은 현미경으로 세포의 사진을 찍을 수 있습니다.
그리드 슬라이드 유리에 부착 챔버 놔. 그리드 슬라이드의 모서리에 부착 챔버의 모서리 중 하나를 맞춥니다. 백작과 여러 격자에 부착 세포의 수를 기록합니다.
큰 플라스틱 양동이 (예 : 유리 섬유 복합 등)에서 MBS - H의 1L를 붓고. 부드럽게 부착 슬라이드 챔버는 양동이의 하단에 넣어. 저속 (- 60rpm 50)에서 5 분 동안 궤도 통에 회전합니다.
이 섹션, 세포 접착 분석의 단계 # 5 한 것으로, 그리드 슬라이드의 같은 코너에 챔버의 동일한 모서리를 정렬, 그리드 슬라이드에 다시 부착 챔버 놔. 당신은 세탁하기 전에 계산이 같은 그리드에 부착 남아 세포의 수를 계산합니다. 세척 후 첨부 남아 세포의 비율을 계산합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO₃ 0.2 g MgSO₄•7H₂O 60 mg CaCl₂•2H₂O 80 mg Ca(NO₃)2•4H₂O₂. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca²⁺/Mg²⁺-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO_{3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.}
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting