La disección del Organizador y explantes Animal Polo de Xenopus laevis embriones y de la Asamblea de un ensayo de adhesión celular

Summary

Este video muestra la técnica utilizada para la preparación de organizador y explantes de animales polo de Xenopus laevis embriones, incluyendo el uso de la cuchilla de cejas - una herramienta especializada disección hecha de una de las cejas. El protocolo para el montaje de un ensayo de adhesión se da también, que las sondas para detectar la presencia de moléculas de adhesión clave presentes en el organizador de la superficie de las células animales o polos que son fundamentales para un desarrollo adecuado.

Protocol

Preparación de Cámaras de adhesión (el día antes de la inyección / disección)

Cámaras de ensayo de adhesión

Si usted tiene un microscopio convencional (óptica localiza sobre el escenario), es ncecessary para hacer una baja altura de la cámara de la adhesión de la siguiente manera. Si se utiliza el microscopio invertido óptica, a continuación, "NUNC Lab-Tek cubreobjetos Recamarado" sólo se puede utilizar, y saltarse los pasos # 1 - 2.

1. Conecte uno de los "presione para sellar aislante de silicio", en una hoja de 40 x 24 mm cubierta. Presione firmemente el aislante de la cubierta antideslizante en la mesa de trabajo limpia y mira desde el otro lado para asegurarse de que el aislante está bien conectado, sin burbujas de aire.
   
   
2. Opcional: Ponga las cámaras de adhesión en una placa de Petri de vidrio con papel de filtro Whatman y autoclave en seco en el ciclo de esterilización. Enfriar hasta temperatura ambiente.

Revestimiento de la Cámara

1. Ponga una gota de 200 ml de solución de trabajo de la cadherina (10mg/ml) o la fibronectina (20mg/ml) en el centro de una cámara de adhesión en autoclave, con sigmacoated puntas amarillas. Incubar a temperatura ambiente durante 4 horas.
   
   
2. Tome la solución cadherina o la fibronectina y la transferencia a un tubo de 1,5 ml. Esta solución puede ser reutilizado para próximas dos semanas.
   
   
3. Dispensar 500 ml de 4% de BSA en 1 × MBS-H para bloquear la cámara. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora.
   
   
4. Aspirar la solución de BSA. Lave la cámara con 500 ml de 1x MBS-H dos veces. Tras el segundo lavado, aspirado de la mayoría de los MBS-H (no completamente), y guárdelo en un recipiente hermético a 4 º C. Esta cámara es buena adherencia para los próximos 2 a 3 días.

La disección y la disociación de los explantes Cap Animal

1. Incubar los embriones inyectados en 0.1x MBS-H, se diluye en el autoclave 1x MBS-H, ya que no lleva a algún medio de autoclave pequeños gérmenes que pueden alterar las células animales disociada de la PAC.
   
   
2. Hacer agarosa 1x Barth platos y CMF-MBS placas de agarosa con platos de 60 mm, por lo menos tanto como el número de muestras. Vierta autoclave 1x MBS-H a las placas de 1 x Barth. Para CMF-MBS platos, verter 10 ml de CMF-MBS.
   
   
3. Cuando los embriones se la etapa 8.5, iniciar la disección de las tapas de los animales en un plato Barth 1x. 10 a 15 explantes por las muestras suelen ser suficientes para un experimento.
   
   
4. La transferencia de los explantes tapa de los animales a una placa de CMF-MBS. Incubar los explantes de 45 a 60 minutos hasta que los explantes están completamente disociados. Agitaciones suaves cada 15 minutos le ayudará a la disociación.

Ensayo de adhesión celular

1. La siembra de las células: Dispensar 500 ml de 1x MBS-H a la cámara de adherencia preparada en los pasos de los apartados anteriores, las Cámaras de ensayo de adhesión y de revestimiento de la Cámara. Transferencia de las células animales disociada tapa de la placa de CMF-MBS a la cámara de adherencia utilizando P200 con puntas amarillas sigmacoated y le cortó-.
   
   
2. Opcional: Si es posible, aspirar con cuidado el medio hasta aproximadamente 2 / 3 a la mitad, sin exponer las células a la atmósfera. Añadir aproximadamente la misma cantidad de agua dulce MBS-H, para asegurarse de que el medio contiene suficiente Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +.}
   
   
3. Incubar a temperatura ambiente durante 45 - 90 minutos. Comprobar que las células de vez en cuando para ver si están vinculados a la superficie inferior.
   
   
4. Ahora usted puede tomar la imagen de las células bajo un microscopio.
   
   
5. Ponga la cámara de adhesión en un portaobjetos de la red. Alinear una de las esquinas de la cámara de la adhesión a una esquina de la diapositiva red. Contar y anotar el número de células adheridas en varias redes diferentes.
   
   
6. Vierta 1 litro de MBS-H en un cubo de plástico de gran tamaño (por ejemplo, Tupperware, etc.) Coloque cuidadosamente la cámara de diapositivas adhesión al fondo de la cubeta. Gírelo en el agitador orbital durante cinco minutos a baja velocidad (50 - 60 RPM).
   
   
7. Ponga la cámara de adhesión de nuevo en la red de diapositivas, la alineación de la misma esquina de la cámara a la misma esquina de la diapositiva de la red, como se hizo en el paso 5 de este artículo, ensayo de adhesión celular. Cuente el número de células que permanecen unidos en la misma red que ha contado antes del lavado. Calcular el porcentaje de células que permanecen unidas después del lavado.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x MBS-H	Buffer			Modified Barth’s medium: 1 L recipe: 5.14 g NaCl7 5 mg KCl 0.2 g NaHCO3 0.2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, free-acidAdjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
CMF-MBS	Buffer			This is Ca2+/Mg2+-free version of MBS-H. 500 mL recipe: 2.57 g NaCl 37.5 mg KCl 0.1 g NaHCO3/sub> 1.19 g HEPES, free-acid Adjust the pH to 7.4 with NaOH. Autoclave.
1% agarose/1x Barth’s plates				as many as the number of samples
1% agarose/CMF-MBS plates				as many as the number of samples
E-Cadherin/Fc chimera	Reagent	Sigma-Aldrich	E-2278	Dissolve 0.1mg of solid E-cadherin in 100ul of 1x MBS-H containing 40% glycerol to make 100x master stock (1.0mg/ml). Store it in –20 °C. Make 1/100 dilution with 1x MBS-H to make 10ug/ml working solution just before you use. You need 200ul per samples of this working solution.
Fibronectin, 0.1% solution	Reagent	Sigma-Aldrich	F-1141	This pre-made solution can be used as 50x stock. Make 1/50 dilution with 1x MBS-H make 20 μg/mL working solution just before you use. You need 200 μL per samples of this working solution. I do NOT recommend using solid Fibronectin, because it is difficult to dissolve at 0.1% concentration to make the stock solution. Although it is more expensive, this pre-made 0.1% solution is better to obtain consistent results.
4% BSA /MBS-H	Buffer			BSA: molecular biology grade fraction V
Sigmacoted yellow tips	Tool
No.1 cover slips				40 mm x 24 mm or 60 mm x 24 mm
Press-to-seal silicon insulator	Tool	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2.5 mm depth x 20 mm diameter
NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass	Tool	Fisher Scientific	12-565-471	2 wells/slides
Grid slide glass	Tool			or Finder graticule for cell counting