Biology

Plastic Embedding und Schnitte von Xenopus laevis Embryonen

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Kunststoffprofile pflegen wahre Gewebemorphologie in dünne Schnitte von Gewebe, das mit fluoreszierenden Sekundärantikörper immungefärbt werden können, so dass diese Methode besser geeignet als Paraffin eingebettet oder Gefrierschnitten für viele Arten von Gewebe. Die Methode zur Färbung-, Kunststoff-Einbettung und Schneiden wird in diesem Video demonstriert.

Protocol

Fixierung

Transfer ganzen Embryonen oder seziert Explantate in MEMFA oder 3,7% FA + PBS in einem kleinen Glasszintillationsröhrchen (Fisher cat # 03-339-25B). Inkubieren Durchstechflasche auf dem Kolbenpendel bei RT nur für 2 Stunden und nicht mehr. Lassen Sie den Embryo in FA für mehr als 2 Stunden. Längere Inkubation in FA wird das embryonale Gewebe härter und führen zu einer schlechten Penetration von Antikörpern in der Detektion.
Saugen Sie die meisten FA und fügen Dent ist Fixativ bis an die Spitze des Fläschchens (~ 4,5 ml). Vorsichtig auf den Kopf der Flasche für ein paar Mal um die Embryonen in Dents waschen, den Austausch mit anderen 4.5ml von frischen Dent ist, und inkubieren sie in -20 º C für mindestens 48 Stunden. Übernachtung ist nicht genug. Dieser Schritt macht die Embryonen durchlässiger für den Antikörper. Embryonen können in diesem Zustand für mehrere Wochen aufbewahrt werden.

Immunfluoreszenz

Rehydrieren die Probe. Inkubieren es in einer abgestuften Reihe von Methanol, wie folgt:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Machen 1,5% Agarose / PBS-Platten mit 60mm Plastikschalen. Gießen PBS auf dem Agarose, nachdem es geworden ist solide.
Hemi-Schnitte der Embryonen: Setzen Sie die Embryonen in einem 1,5% Agarose / PBS Platte. Schnappen eines Embryos mit einer Pinzette und schneiden Sie es in der Hälfte durch die Mitte des Embryos mit einem dünnen Rasierklinge. Wählen Sie diejenigen, die Sie erfolgreich in die Hälfte haben mit einem geraden Schnittebene geschnitten.
Übertragen Sie die halbierten Embryonen in einen Glasszintillationsröhrchen mit PBT. Austausch mit 4.5ml 20% Ziegenserum + PBT. Inkubation bei RT für 2 Stunden auf einem Kolbenpendel (Blocking).
Eine geeignete Verdünnung des primären Antikörpers in PBT. 0,5 ml dieser Proben pro benötigt wird. Zum Beispiel habe ich 1 / 200 Verdünnung des Kaninchen-Anti-C-Cadherin pAb die subzelluläre Lokalisation von C-Cadherin in 5mm Kunststoff Abschnitte zu studieren.
Absaugen der Blockierungslösung und fügen 0,5 ml des verdünnten primären Antikörper. Legen Sie die Fläschchen in Stand-up-Position auf einem Styropor-Rohrhalter. Inkubieren über Nacht bei 4 º C auf einem Kolbenpendel.
Entfernen Sie die verdünnten primären Antikörper (dieser verdünnten primären Antikörper können gespeichert und wiederverwendet werden in den nächsten 1-2 Wochen). Waschen mit 4,5 ml des PBT für 4-fach (40-60 Minuten) bei RT.
Exchange mit 0,5 ml 1 / 100 Verdünnung des Biotin-konjugierten sekundären Antikörper in PBT. Inkubieren über Nacht bei 4 º C auf einem Kolbenpendel. Decken Sie die Röhrchen mit Alu-Folie an Biotin vor Licht zu schützen.
Ab diesem Zeitpunkt sollte darauf geachtet werden, um die Probe vor Licht, dh zu schützen, halten Sie die Fläschchen unter einigen Abdeckung oder Alufolie werden.
Entfernen Sie die Biotin-Sekundär-Antikörper (dies kann auch in den nächsten 1-2 Wochen wieder verwendet werden). Wash mit oder 4.5ml von PBT für 4-fach (40-60 Minuten) bei RT.
Exchange mit 0,5 ml 1 / 200 Verdünnung des fluoreszenzmarkierten (FITC, Texas-Rot, etc.) Streptavidin in PBT. Inkubieren über Nacht bei 4 º C auf einem Kolbenpendel.
Entfernen Sie das Streptavidin (diese können wiederverwendet werden kann). Waschen mit 4,5 ml des PBT für 3-mal (15 bis 30 Minuten) bei RT.
Fix die Embryonen in 4,5 ml von 3,7% FA + PBS für 30 Minuten bei RT.
Waschen mit 4,5 ml PBS zweimal.
Entwässern der Probe. Inkubieren es in einer abgestuften Reihe von Ethanol, wie folgt:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
Die Probe kann in 100% EtOH bei 4 º C mit einer Abdeckung, um sie vor Licht zu schützen gespeichert werden.

Infiltration

Machen Technovit 7100 Infiltration zu mischen. Ich mache für gewöhnlich 15ml der Basis Flüssigkeit in einem 50ml konischen Rohr, fügen 150mg Härter I und mischen Sie es mit Schaukeln auf einem Kolbenpendel für 15 Minuten. Diese Infiltration Mischung kann bei 4 ° C aufbewahrt werden bis zu einem Monat.
Infiltrate der Probe mit der Infiltration Mix durch den Austausch mit einer abgestuften Reihe von Technovit Infiltration mix / EtOH-Combo, wie folgt:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 Stunde
2. 100% Technovit - 1 Stunde
3. 100% Technovit - Übernachtung
Die specimen kann in der 100%-Infiltration Mix gelagert werden bis zu einem Monat bei 4 º C. Setzen Sie einen Deckel auf die Proben, um sie vor Licht zu schützen.

Embedding

Machen Technovit 7100 Einbettung Mix: Take 0,75 ml der Infiltration Mix in einem 1,5 ml Tube und füge 50 ml Härter II. Mix it durch Invertieren des Röhrchens mehrmals.
Mit einem Kunststoff Transferpipette, nehmen Sie eine Probe infiltriert über Nacht in 0,5 ml dünnwandigen PCR-Röhrchen. Entfernen Sie die meisten der Überstand.
Add 0,25 ml der Einbettung Mischung in Schritt 1 dieses Abschnitts, "Embedding", auf die Probe gestellt. Richten Sie die halbierten Embryo in die Dissektionsfläche Blick auf den Boden des Röhrchens zu machen, indem Sie vorsichtig nudging mit einer stumpfen Nadel-Spitze Dissektion (Holz-Griff Dissektion Nadel).
Schließen Sie den Deckel und inkubieren das Rohr an einem dunklen Ort für ca. 4 Stunden, damit der Kunststoff polymerisieren.
Machen Technovit 3040 mischen. Nehmen Sie 1 Gramm des Pulvers auf eine Waagschale, und fügen Sie 0,5 ml der Flüssigkeit. Sofort-Mix Pulver und Flüssigkeit mit einem bluetip. Füllen Sie auf der gehärteten spacimen. Diese gelbe Technovit 3040 wird die gesamte Kunststoff-Block kommen aus dem Rohr zu verhindern.

Sectioning

Wischen Histoknife H mit Xylol (EtOH ist oft nicht gut genug) und setzen Sie ihn auf Ihrer Mikrotom. Angle die Klinge bei etwa 45 °. Wischen Sie die Bühnenfläche vor der Klinge mit Xylol, auch, weil die Reinheit diesem Bereich ist entscheidend für die Qualität der geschnittenen Scheiben schneiden.
Schneiden Sie die Seite des Rohres und schälen die Spitze aus mit einer Pappe Messer.
Stellen Sie die Probe in das Futter Inhaber des Mikrotoms.
Bringen Sie ein "press-to-Siegel" Silizium-Isolator auf einem Objektträger auf einer Montageplatte Kammer für Schnittscheiben machen. Drücken Sie das Isolator, um die Folie auf sauberen Tisch-und schaue von der anderen Seite, um sicherzustellen, dass der Isolator vollständig ohne Luftblasen befestigt. Gießen Sie sauber und warm dH ₂ O (~ 40 ° C), um den Pool auf der Folie mit einer Pasteurpipette, bis auf die Ebene, wo sie sehen, dass die Wasseroberfläche flach, nicht konkav oder konvex in Form wird können.
Beginnen Sie mit Abschnitt Scheiben schneiden. Für Immunfluoreszenz-Studien, mache ich 5 mm Abschnitt Scheiben schneiden. Für in-situ-Hybridisierung Proben kann die Dicke der Scheiben im Bereich von ~ 3 eingestellt werden - 8 mm, je nach Zweck und die Intensitäten der Signale.
Tragen Sie den Abschnitt Scheiben von der Bühne vor der Klinge an der Montageplatte wird mit Wasser gefüllt, mit einem kleinen Pinsel. Halten Sie den Pinsel mit einer Scheibe auf der Oberseite des Schwimmbad-and-Drop die Scheibe hinunter zum Wasser durch Klopfen mit einem matt-Spitze Dissektion Nadel. Die Scheibe wird in eine runde Form so bald erweitern, da sie die Oberfläche des Wassers Treffer.
Wenn die meisten der Wasserfläche der Montage Kammer mit Schnittscheiben gefüllt ist, saugen fast die Hälfte des Wassers mit einer Pasteurpipette. Inkubieren Sie die Folie auf einer Folie wärmer Nacht, um die Probe vollständig zu trocknen.
Counter-Fleck mit 1 ml DAPI (0.1mg/ml in TE) für fünf Minuten. Saugen Sie DAPI und trocknen Sie die Probe.
Entfernen Sie das Silikon-Kautschuk-Isolator aus der Folie. Jetzt Bilder können von der Probe entnommen werden. Bewahren Sie die Probe bei 4 ° C, vor Licht geschützt.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.