Biology

Plastik gömülmesi ve Xenopus laevis Embriyolar Kesit

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Plastik bölümleri, parafine gömülü ya da dondurulmuş bölümleri daha birçok doku türleri için bu yöntem daha kullanışlı hale getirmek, floresan sekonder antikor ile boyanmış doku ince bölümlerde gerçek doku morfolojisi korumak. Bu video boyama, plastik gömme ve kesit yöntemi gösterilmiştir.

Protocol

Tespit

(Fisher kedi # 03-339-25b), küçük bir bardak sintilasyon flakon MEMFA ya da% 3.7 FA + PBS bütün embriyolar veya disseke eksplantlar aktarın. Bundan daha fazla değil, sadece 2 saat RT nutator flakon inkübe ve . FA embriyo 2 saatten fazla bırakmayın. FA uzun inkübasyon embriyonik doku zorlaştırır ve algılama süreci antikorlar fakir bir penetrasyon ile sonuçlanabilir.
FA aspire ve Dent fiksatif flakon (~ 4.5ml) üstüne ekleyin. Yavaşça başka bir 4.5ml ile taze Dent Dent döviz embriyoların yıkamak için flakon birkaç kez ters ve -20 º C en az 48 saat süreyle inkübe edin. Gecelik yeterli DEĞİLDİR. Bu adım, antikor embriyolar daha geçirgen hale getirir. Embriyolar bu durum birkaç hafta saklanabilir.

İmmünofloresan

Örnek rehidrate. Aşağıdaki gibi, metanol kademeli dizi inkübe:

% 75 MeOH / H ₂ O 10dk
% 50 MeOH / PBS 10dk
% 25 MeOH / PBS 10dk
PBS 10dk
PBS 10dk
60mm plastik tabaklar ile% 1.5 agaroz / PBS plakaları olun. Agaroz üst katı haline geldikten sonra PBS dökün.
Embriyoların Hemi-kesit:% 1.5 agaroz / PBS plaka embriyolar koyun. Forseps bir çift ile bir embriyo kapın ve ince bir jilet kullanarak embriyonun merkezi aracılığıyla ikiye kesmek. Düz bir kesim uçağı başarıyla yarıya olduğunu olanları seçin.
Ikiye embriyolar, bir cam sintilasyon PBT şişenin içine aktarın. % 20 keçi serum + PBT 4.5ml ile değişimi. Nutator (Engelleme) 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
PBT birincil antikor uygun bir seyreltme hazırlayın. Bu başına örneklerinin 0.5 ml gereklidir. Örneğin, ben C-cadherin 5mm plastik bölümlerde hücre içi lokalizasyonu çalışma tavşan anti-C-kaderin PAB 1 / 200 dilüsyon kullanılır.
Engelleme çözüm aspire ve seyreltilmiş primer antikor 0.5 ml ekleyin. Şişeleri, plastik bir tüp tutucu stand-up pozisyonda yerleştirin. Bir nutator 4 º C'de bir gece inkübe edin.
Seyreltilmiş birincil antikor (Bu seyreltilmiş primer antikor kaydedilir ve sonraki 1-2 hafta içinde tekrar edilebilir) çıkarın. RT az 4 kez, her biri (40-60 dakika) için PBT 4.5ml ile yıkayın.
1 / 100 dilüsyon PBT Biotin-konjuge sekonder antikor 0.5 ml ile değişimi. Bir nutator 4 º C'de bir gece inkübe edin. Biotin ışıktan korumak için alüminyum folyo ile şişeleri örtün.
Bu noktadan itibaren, bakım, ışık, yani örnek korumak için bazı kapak veya alüminyum folyo altında şişeleri tutmak alınmalıdır .
Biotin ikincil antikor (bu da önümüzdeki 1-2 hafta içinde tekrar edilebilir) çıkarın. RT (her biri 40-60 dakika) ya da 4 kez PBT 4.5ml yıkayın.
PBT içinde Streptavidin (FITC, Texas-kırmızı, vb.) Floresan etiketli 1 / 200 dilüsyon ile Alım Satım 0.5 ml. Bir nutator 4 º C'de bir gece inkübe edin.
Streptavidin (bu da, yeniden olabilir) çıkarın. RT (her biri 30 dakikalık 15), 3 kez için PBT 4.5ml ile yıkayınız.
RT 30 dakika süreyle% 3.7 FA + PBS 4.5ml Fix embriyoların.
Iki kez PBS 4.5ml ile yıkayın.
Örnek dehydrate. Aşağıdaki gibi, etanol kademeli dizi inkübe:

% 30 EtOH / H ₂ O 10 dakika
% 50 EtOH / H ₂ O 10 dakika
% 75 EtOH / H ₂ O 10 dakika
100% EtOH 10 dakika
Örnek ışıktan korumak için bir kapak ile 4 º C'de% 100 EtOH saklanabilir.

Sızma

Technovit 7100 infiltrasyon karışımı olun. Ben genellikle, 50ml, konik tüp baz sıvı 15ml sertleştirici 150mg ekleyin ve 15 dakika boyunca nutator sallayarak karıştırın. Bu infiltrasyon karışımı bir ay kadar 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
Technovit infiltrasyon mix / EtOH açılan kademeli serisi ile alışverişi infiltrasyon karışımı ile örnek Infiltrate, aşağıdaki gibi:
1. % 50 Technovit / EtOH - 1 saat
2. % 100 Technovit - 1 saat
3. % 100 Technovit - gecede
Specimen 4 º C'de% 100 infiltrasyon karışımı bir ay kadar saklanabilir. Numuneler üzerinde ışıktan korumak için bir kapak koyun.

Gömülmesi

Technovit 7100 gömme karışımı olun: 1.5ml bir tüp içinde infiltrasyon karışımı 0.75ml ve sertleştirici II 50ml ekleyin. Tersine tüp birkaç kez karıştırın.
, Plastik bir transfer pipet kullanarak, gece 0.5 ml ince duvarlı PCR tüp içine sızmış bir örnek alır. Süpernatantı çıkarın.
0.25ml numune için bu bölümü adım # 1, "Gömme", yapılan gömme karışımı ekleyin. Orient sıkıcı bir ucu diseksiyon iğne (diseksiyon iğnesi ahşap saplı) ile hafifçe dürtmek, tüp aşağıya doğru bakacak şekilde diseksiyon düzlemi ikiye embriyo.
Kapağını kapatın ve yaklaşık dört saat boyunca karanlık bir yerde tüp inkübe plastik polimerize izin verecek.
Technovit 3040 karışımı olun. Tozu 1 gram ağırlığında bir çanak alın ve 0.5 ml sıvı ekleyin. Hemen bir bluetip kullanarak toz ve sıvı karıştırın. Sertleştirilmiş spacimen üstüne dökün. Bu sarı Technovit 3040 tüpten çıkan tüm plastik blok önleyecektir.

Kesit

Ksilen Histoknife H Bezi (EtOH genellikle yeterince iyi değil) ve sizin mikrotom ayarlayın. Yaklaşık 45 ° 'de bıçak açısı. Bu alanın temizliği kesitli dilim kalitesi çok önemli, çünkü, çok, ksilen ile bıçağın önünde sahne alan silin.
Tüp tarafında kesin ve karton bir bıçak kullanarak kapalı ucu kabuğu.
Mikrotom mandren tutucu örnek ayarlayın.
Bölüm dilim için bir montaj odasına bir slayt camına "basın-seal" silikon izolatör takın. Temiz benchtop slayt sıkıca yalıtkan basın ve yalıtkan herhangi bir hava kabarcıkları olmadan tamamen takılı olduğundan emin olun diğer taraftan bakın. Pasteur pipeti kullanarak slayt havuz, su yüzeyi, düz, iç bükey değil ya da şekil olarak dışbükey hale olduğu görülebilir seviyeye kadar temiz ve _{sıcak dH} 2 O (~ 40 ° C) dökün.
Bölüm dilim yapmaya başlayın. Immunofloresan çalışmalar için 5 mm bölüm dilim olun. - 8 mm sinyallerin amacı ve yoğunluklarına bağlı olarak, in situ hibridizasyon örnekleri için, dilimlerin kalınlığı ~ 3 aralığında ayarlanabilir olabilir .
Küçük bir fırça kullanarak, bölüm dilim bıçak önünde sahne su ile montaj odasına taşıyın. Su havuzunun üstüne bir dilim fırça tutun ve sıkıcı bir ucu diseksiyon iğne ile vurmak suretiyle su dilim aşağı açılır. Su yüzeyine vurur dilim en kısa sürede dairesel bir şekil genişletmek olacaktır.
Montaj odasına su yüzey alanının en kesit dilimleri ile dolduğunda, Pasteur pipeti kullanarak suyun neredeyse yarısı kadar emmek. Örnek tamamen kuru bir slayt sıcak gecede slayt inkübe edin.
Counter-beş dakika için DAPI (TE içinde 0.1mg/ml) 1ml leke. Aspire DAPI ve örnek kurulayın.
Slayt silikon kauçuk yalıtkan çıkarın. Şimdi resimler örnek alınabilir. 4 örnek Mağaza ° C, ışıktan korunmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.