Summary
Alzheimer hastalığının bir özelliği Aβ yükseklik.
Abstract
Sinaptik bağlantıları değer düşüklüğü, Alzheimer Hastalığı (AH) erken aşamalarında ortaya çıkan ince amnezik değişikliklerin altında yatan muhtemel. β-amiloid (Aβ), AD yüksek miktarlarda üretilen bir peptid, hücresel bir öğrenme ve hafıza ile ilişkili Uzun Vadeli potansiyelize (LTP), azaltmak için bilinir. Gerçekten de, Aβ neden LTP bozukluğu AD modelleri ve sinaptik işlev bozuklukları gibi sinaptik bozuklukları azaltıcı veya geri alınmasının yeteneğine tarama ilaçlar için eğitim için yararlı bir deneysel paradigma. Çalışmalar Aβ oligomerik formu ile tercihen LTP bozulma ürettiğini göstermiştir. Burada oligomerized sentetik perfüzyon akut hipokampal dilimleri üzerine Aβ1-42 peptid bozarak LTP için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu video, oligomerik Aβ hazırlanması için adım adım prosedürü anahat
Protocol
Resuspending β-amiloid peptid
Başlamadan önce hazır olması:
- Aβ 1-42 (liyofilize toz)
- 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP)
- Düşük bağlayıcı polipropilen mikrosantrifüj tüpleri (1,5 ml)
- Teflon dalma durağı (250 ul) ile gaz geçirmez Hamilton şırınga
- Dimethylsülfoksit (DMSO)
- Liyofilize Aβ 1-42 peptid flakon açılması üzerine yoğunlaşmayı önlemek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında dengeye izin verin.
- 1 mM bir çözüm elde etmek için birkaç saniye için vorteks çözüm davlumbaz altında, buz gibi HFIP Aβ 1-42 peptid yeniden askıya .
- Teflon fişi ile gaz geçirmez bir cam Hamilton şırınga kullanarak, hızlı bir şekilde eşit olarak üç polipropilen şişeleri içine Aβ 1-42 / HFIP çözüm bölmek ve şişeleri mühür.
- Daha sonra şişeleri Aβ monomerization izin vermek için 2 saat süreyle inkübe edilir. Daha sonra, şişeleri açık ve net bir peptid filmi şişeleri alt kısmında görülmektedir kadar SpeedVac santrifüj (800 gr, oda sıcaklığı) ile vakum altında Aβ 1-42 / HFIP çözümü konsantre. Peptid bozulmasını önlemek için (max 25 ° C) SpeedVac santrifüj içinde sıcaklık dikkatle kontrol edin.
- Şişeleri Seal ve alikotları saklamak -80 ° C Aβ filmi 6 ay boyunca saklanabilir.
- 5 mM Aβ 1-42 kadar bir konsantrasyon elde etmek için DMSO ekleyerek bir film yeniden askıya aldı. Yeniden süspansiyon sağlamak için 10 dakika su banyosunda sonikasyon.
- Polipropilen şişeleri içine kısım 5mM Aβ 1-42 çözüm. Tüm şişeleri Seal ve -20 ° C'de saklayın Alikot sadece bir kez çözdürülmelidir. Dondurucunun içine su yoğunlaşma dikkat edin. Peptitler çözelti içinde çok kolay bir şekilde bozulmasına yol açar.
Oligomerization
Başlamadan önce hazır olması:
- Aβ 1-42 / DMSO (5mM)
- Steril fosfat tamponu
- Düşük bağlayıcı polipropilen mikrosantrifüj tüpleri (1,5 ml)
- Düşük bağlayıcı polipropilen santrifüj tüplerine (50 ml)
- Elde edilen 5mM Aβ 1-42 / steril fosfat tamponu (100 ul) DMSO kısım sulandırınız.
- 30 saniye vorteksleyin ve daha sonra 12 saat boyunca inkübe 4 ° C
Hipokampal dilim tedavisi
Hipokampal dilim tedavi ederken, bardak, perfüzyon boru yüzeyleri ve kayıt odasının üzerine non-spesifik peptid yapışmasını önlemek için önemlidir. Düşük bağlayıcı polipropilen boru ve kaplarda tercihen kullanın. Züccaciye veya genel plastik eşya kullanmaktan kaçının. Perfüzyon medya serum veya albümin ücretsiz olmalıdır.
Aβ perfüzyon
Başlamadan önce hazır olması:
- Oligomerized Aβ 1-42
- Kayıt tampon (mM: 124 NaCl, 4.4 KCl, NaHCO 3, 2 1 Na 2 HPO 4, 25 CaCl 2, 2 MgCl 2, ve 10 glukoz)
- Arabirimi odasına set-up Elektrofizyolojik kayıt
- Oksijenli kayıt tampon sonrası diseksiyon için en az 90 dakika inkübe Enine hipokampal dilimleri (T = 29 ° C sabit perfüzyon oranı = 2 ml / dakika)
- Hemen önce deneme için uygun çalışma konsantrasyonu (200 nM veya daha yüksek), oksijenli ön kayıt tamponu ile bir polipropilen tüp oligomerized Aβ 1-42 kısım sulandırmak.
- 20 dakika boyunca sinaptik plastisite indüksiyonundan önce dilimleri Aβ 1-42 çözüm serpmek.
Plastisite İndüksiyon ve takip
- Tipik olarak, en yaygın kullanılan model sinaptik plastisite LTP. Hipokampus verilen bir sinaps tetanik stimülasyon ile indüklenen olabilir. Shaffer 'in teminat projeksiyonları ve stratum radiatum CA1 piramidal nöronlar arasındaki sinapsların alan yanıtları kaydedin. Bizim tetanik stimülasyon, 15 saniyelik aralıklarla ayrılmış 3 trenler içeren bir teta burst stimülasyon oluşur. Her tren, her patlama, 100 Hz 5 bakliyat gerektirir 5 Hz de 10 patlamaları oluşur. Tetanik stimülasyon oligomerized Aβ perfüzyon tamamlandıktan hemen sonra uygulayın.
- Tetanik stimülasyon normal kayıt tampon ile perfüzyon hemen sonra geri dönmek. Deney süresi boyunca sabit bir perfüzyon oranı, kayıt odasının sıcaklığı ve uygun oksijenasyon koruyun.
Temsilcisi Sonuçlar ve olası sorunları
Stine et coll klasik protokol 1, göre oligomerized Aβ Aβ monomerlerin ve bir çok farklı boyutu, oligomerler üretir(dimer, trimer, vb.) oligomerized, perfüzyon Aβ 1-42 Aβ ile tedavi edilen dilimleri içinde kontrol dilimlerine göre azalma LTP yol açar. Erkek fareler 3-5 ay eski C57BL/6J deneysel koşullar altında, LTP değerleri kontrol dilimler halinde ise LTP 200 nm Aβ ile tedavi edilen dilimleri, iki saat sonra tetanik stimülasyon temel değerleri ortalama% 150 baseline2 ortalama 200-250%. Bazı durumlarda, Aβ ile tedavi hipokampal LTP azaltmak için başarısız olabilir. Birkaç kritik hatalar oluşabilir Aβ konsantrasyon ve eksik oligomerization sırasında aşırı film kurutma içerir. Hipokampal dilimleri Aβ perfüzyon plastik non-spesifik yapışma eğilimli çözüm Aβ peptid, fizikokimyasal özellikleri nedeniyle endişe başka bir kaynak olabilir. Bu konuların Sorun Giderme altında tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda açıklandığı gibi, oligomerik Aβ hazırlanması bozulmamış LTP çeşitli sorunlara neden olabilir. Aβ bozulması veya Aβ oligomerization eksikliği oluşmuş olabilir olmadığını değerlendirmek için bir yolu TRIS Tricine SAYFA / Western Blot analizi ve analitik Ultrasantrifügasyon (Bu protokol açıklanmayan) kullanarak Aβ hazırlık değerlendirmektir. Western Blot örnekleri non-denaturing/non-reducing koşulları altında hazırlanan, başarılı bir hazırlık monomerlerin ve farklı oligomerler 3 numaralı bantlar bir Western Blot imza oluşturmanız gerekir. Bir konu sık sık meydana gelen SpeedVac konsantratör kurutma adımı sırasında peptid istikrarsızlık. Aslında, yüksek sıcaklıkta kurutma işaretli peptid kahverengi renklenme tarafından fark, protein parçalanması yol açar. HFIP çözüm Konsantrasyon dikkatle oda sıcaklığında gerçekleştirilen ve izlenir olması. Protokolünde ortaya çıkan çeşitli işlemler göz önüne alındığında, seyreltme hataları, yanlışlıkla, kötü oligomerization ya da yanıltıcı Aβ konsantrasyon yol açabilir. İlginçtir ki, önerilen daha düşük Aβ konsantrasyonları ile perfüzyon artan LTP değerleri 3 neden olacaktır. Yine, perfüzyon dilim Aβ tedavi olası sonucu etkiler. Gerçekten de, elektrofizyolojik deneylerde banyo çözüm sabit bir sıcaklıkta muhafaza sıcaklığı fosfat tampon içinde çözülmesi Aβ konformasyonlar etkileyecek bilindiği gibi kritik öneme sahiptir. Bir başka endişe kaynağı oligomerik Aβ non-spesifik olarak hazırlanması ve perfüzyon böylece hipokampal dilim maruz etkin konsantrasyon azaltılması için kullanılan kaplar ve tüp plastik yüzeylere yapışabilir. Bu nedenle, farklı deneyler boyunca güvenilir hazırlıkları ve perfüzyonunu sağlamak için düşük protein bağlayıcı plastik eşya kullanımı için kritik. Bu sayımızda, 4 farklı Aβ türlerin oranı etkilemediği gösterilmiştir polipropilen plastik-ware öneriyoruz. Geniş edebiyat, Alzheimer Hastalığı, sinaptik bozukluk 5 olarak çıktığını göstermektedir. Amnezik erken belirtileri, beyin hasarı başka herhangi bir klinik bulguların yokluğunda meydana incelik ve değişkenlik, Aβ türleri tarafından üretilen en azından bir kısmını tek bir sinaps işlevini ayrık değişiklikler, (bağlı olması muhtemeldir örneğin Aβ 42 ve Aβ 40) 2,6,7,8. Oligomerized sentetik Aβ 1-42 içeren bir hazırlık in vitro LTP 9 bozabilir keşif beyinde Aβ yükselmesi ile indüklenen sinaptik disfonksiyon mekanizmaları içine sayısız soruşturma açmıştır. Bu protokolü kullanarak, biz başarılı bir şekilde hipokampal dilim Shaffer teminat stratum radiatum bağlantı LTP bozar oligomerik Aβ hazırlanması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu deneysel paradigma Aβ-aracılı patogenez mekanizmaları araştıran yanı sıra, sinaptik disfonksiyon 2,10,11 hafifletebilir potansiyel ilaçlar, test için büyük bir değeri vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Columbia Üniversitesi IACUC tarafından belirtilen kurallar ve düzenlemelere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) (NS049442) tarafından desteklenmiştir.>
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aβ 1-42 (lyophilized) | American Peptide | 62-0-80 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-Propanol (HFIP) | Fluka | 52517 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Biotium, Inc. | 90082 | |
| 50mL Polypropylene Centrifuge Tubes | Corning | 05-538-67 | |
| 1.5ml MaxyClear microtubes Maximum recovery | Axygen Scientific | MCT-150-L-C | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Invitrogen | 10010-023 | |
| GASTIGHT Syringes 250 μL | Hamilton Co | 1725 | |
| Bath sonicator | Branson | 3510 | |
| Savant SpeedVac Concentrator System | Various | SC 110A |
References
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).
- Vitolo, O. V. Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).
- Puzzo, D. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).
- Lewczuk, P. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52, 332-334 (2006).
- Masliah, E. Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).
- Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments. Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).
- Itoh, A. Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats. Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).
- Walsh, D. M. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416, 535-539 (2002).
- Lambert, M. P. nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).
- Gong, B. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 126, 775-788 (2006).
- Trinchese, F. Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease. J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).
