Biology

塑料嵌入和非洲爪蟾胚胎切片

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

塑料型材保持在薄薄的组织，可以用荧光抗体免疫染色的部分真正的组织形态，这种方法比较有用的，比许多类型的组织石蜡包埋或冰冻切片。染色，塑料包埋，切片的方法是在这个视频演示。

Protocol

固定

在一个小玻璃闪烁瓶转移整个胚胎或解剖植（费舍尔猫＃03 - 339 - 25B）到MEMFA或3.7％FA + PBS。在室温孵育nutator小瓶，只有 2个小时，而不是不止于此。不要离开2个多小时的胚胎在FA。在FA的潜伏期较长，会使胚胎组织的困难，并导致在检测过程中的抗体差渗透。
吸大部分的FA和添加登特的固定液的小瓶（〜4.5毫升）顶部。轻轻颠倒几次小瓶洗登特的胚胎，用另一种新鲜的凹痕4.5毫升交流，并在-20 ° C 孵育至少48小时。隔夜不足够的。这一步使胚胎抗体的渗透性。胚胎可以保持在这几个星期的情况下。

免疫

补充水分的标本。在甲醇梯度培养，如下：

75％甲醇/ H _{2 O} 10分钟
50％甲醇/ PBS 10分钟
25％甲醇/ PBS 10分钟
PBS 10分钟
PBS 10分钟
60毫米塑料菜1.5％琼脂糖/ PBS板。倒入琼脂糖上PBS后，它已成为固体。
半胚胎切片 ：将在1.5％琼脂糖/ PBS板的胚胎。一双镊子抓住一个胚胎，并削减了一半的胚胎，用薄薄的刀片中心。选择，您已成功地削减了一半，直切平面的。
平分胚胎转移到与PBT的玻璃闪烁瓶。交流4.5毫升的20％山羊血清+ PBT。在室温下孵育2小时上nutator（阻塞）。
准备适当稀释，在PBT的主要抗体。这每样本0.5毫升是必要的。例如，我用1 / 200稀释的兔抗c - cadherin的多克隆研究在5mm的塑料型材的C - cadherin的亚细胞定位。
吸出阻塞的解决方案，并添加稀释的抗体0.5毫升。在泡沫塑料管持有人站立位置的小瓶。在nutator 4 º C孵育过夜。
将稀释的抗体（这种稀释的抗体可以保存并在未来1-2周重复使用）。与PBT的4.5毫升洗4次（每次40-60分钟）在室温下。
交换的1 / 100稀释生物素标记的第二抗体在PBT0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。用铝箔盖住，以防止光素的小瓶。
从这一点来说， 应采取保护光，即样品，保留下一些盖或铝箔的小瓶。
删除中学生物素的抗体（这也可以在未来的1-2周重复使用）。洗或PBT4.5毫升4倍（40-60分钟）在室温。
交换的1 / 200稀释的荧光标记（FITC，德克萨斯红等），在PBT链霉0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。
卸下的链霉（可重复使用，这太）。与PBT的4.5毫升洗3次（15 - 30分钟）在室温下。
30分钟，在室温下固定在3.7％FA + PBS4.5毫升胚胎。
与PBS4.5毫升洗两次。
脱水标本。孵育在乙醇分级系列，如下：

30％的乙醇/ H ₂ O 10分钟
50％乙醇/ H _{2 O} 10分钟
75％乙醇/ H _{2 O} 10分钟
100％乙醇 10分钟
试样可存储100％乙醇在4 º C具有保护盖由轻。

浸润

Technovit 7100渗透混合。我通常在50ml的锥形管的基液15毫升，添加固化剂150毫克的我，并为15分钟nutator摇摆混合。这种渗透组合，可以保持在4 ° C至一个月。
渗透与渗透混合标本，通过交流与Technovit渗透的混合/乙醇组合分级系列，如下：
1. Technovit /乙醇 - 1小时50％
2. 100％Technovit - 1小时
3. 100％Technovit - 隔夜
该specimen可以在100％的渗透混合存储长达一个月在4 ° C。样品放在封面，以保护他们的光。

嵌入

Technovit 7100嵌入组合：以0.75毫升渗透在1.5毫升管组合，并添加固化剂二50毫升。颠倒几次管混合。
用塑料移液管，取一个试样渗透到0.5ml薄壁PCR管中过夜。删除的大部分上清。
添加在本节步骤＃1，“嵌入”，在试样上的嵌入组合0.25毫升。东方平分胚胎面临的试管底部夹层平面，轻轻地用钝尖清扫针（木处理清扫针）轻推。
关闭盖子，并在黑暗的地方约四小时，孵化管允许的塑料聚合。
请Technovit 3040组合。称量皿中以1克的粉末，而添加的液体0.5毫升。随即，混合粉末和液体使用bluetip。倒入硬化spacimen顶部。这黄色的Technovit 3040，防止来自管整个塑料块。

切片

请用二甲苯Histoknife H（乙醇往往是不够好），并设置您的切片。角度约45 °的刀片。用二甲苯擦拭刀片前面舞台区，也因为这方面的清洁切片切片质量的关键。
切管方和剥离，关闭使用的纸板刀的尖端。
设置成夹头持有人的切片标本。
一个载玻片上附加一个“按密封”绝缘体上硅，使安装节片室。用力按下绝缘体清洁台式幻灯片，从另一个侧面看，以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。倒干净，温馨的_{DH 2} O（〜40℃）使用巴斯德吸管的幻灯片池，这里可以看出，水面变得平缓，没有凹或凸的形状的水平。
开始节片。对于免疫的研究，我5毫米的节片。原位杂交样品中，可以调整切片的厚度在〜3 - 8毫米的范围内，根据目的和信号强度。
卡里的节片从刀片前面阶段的安装与水室，用一个小的画笔。一片水池上方握住画笔和降片敲钝尖清扫针水。片将扩大成圆形，尽快到达水面。
当安装室内的水面面积大部分是充满节片，几乎一半的水使用巴斯德吸管吸。孵育幻灯片温暖过夜，以使样品完全干燥的幻灯片。
反染色的DAPI（在TE为0.1mg/ml）1毫升五分钟。吸DAPI染色和干燥的样品。
从幻灯片中删除的硅橡胶绝缘子。现在可以采取的样品图片。样品存放在4℃，避光。

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.