प्लास्टिक एम्बेड और Xenopus laevis भ्रूण के सेक्शनिंग

Summary

प्लास्टिक वर्गों है कि फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ immunostained किया जा सकता है है ऊतक की पतली वर्गों में सच ऊतक आकारिकी बनाए रखने के लिए, इस विधि के ऊतकों के कई प्रकार के के लिए आयल - एम्बेडेड या जमे हुए वर्गों की तुलना में अधिक उपयोगी बनाने. धुंधला हो जाना, प्लास्टिक एम्बेडिंग, और सेक्शनिंग के लिए विधि इस वीडियो में प्रदर्शन किया है.

Protocol

फिक्सेशन

1. MEMFA या 3.7% एफए + पीबीएस में पूरे भ्रूण या dissected explants एक छोटा गिलास जगमगाहट शीशी में स्थानांतरण (फिशर 03-339-25B # बिल्ली). आरटी पर nutator पर सेते शीशी, केवल 2 घंटे के लिए, कि अधिक से अधिक नहीं है और. एफए में अधिक से अधिक 2 घंटे के लिए भ्रूण को छोड़ मत करो. एफए में अब ऊष्मायन भ्रूण ऊतक कठिन बनाने के लिए और पता लगाने की प्रक्रिया में एक एंटीबॉडी के गरीब पैठ में परिणाम देगा.
   
   
2. एफए के सबसे Aspirate और सेंध लगानेवाला शीशी (~ 4.5ml) के शीर्ष करने के लिए जोड़ने. धीरे सेंध में भ्रूण धोने, ताजा सेंध का एक और 4.5ml के साथ विनिमय के लिए कुछ समय के लिए शीशी पलटना, और -20 डिग्री सेल्सियस में यह कम से कम 48 घंटे के लिए सेते हैं. ओवरनाइट पर्याप्त नहीं है. यह कदम भ्रूण अधिक एंटीबॉडी के लिए पारगम्य बनाता है. भ्रूण कई हफ्तों के लिए इस हालत में रखा जा सकता है है.

Immunofluorescence

1. नमूना rehydrate. यह मेथनॉल के एक वर्गीकृत श्रृंखला में सेते हैं, के रूप में इस प्रकार है:
   
   

   75% MeOH / एच 2 हे	10min
   50% / MeOH पीबीएस	10min
   25% / MeOH पीबीएस	10min
   पीबीएस	10min
   पीबीएस	10min

   
   
2. 60mm प्लास्टिक के बर्तन के साथ 1.5% agarose / पीबीएस प्लेटें बनाओ. Agarose के शीर्ष पर पीबीएस डालो के बाद यह ठोस बन गया है.
   
   
3. भ्रूण की Hemi सेक्शनिंग: 1.5% agarose पीबीएस प्लेट / में भ्रूण रखो. संदंश की एक जोड़ी के साथ एक भ्रूण ले लो और यह एक पतली धार का उपयोग भ्रूण के केंद्र के माध्यम से आधे में कटौती. जो कि आप को सफलतापूर्वक एक सीधे काटने के विमान के साथ आधे में कटौती चुनें.
   
   
   
   
4. पीबीटी के साथ एक गिलास जगमगाहट शीशी में bisected भ्रूण स्थानांतरण. 4.5ml 20% + सीरम पीबीटी बकरी के साथ विनिमय. आरटी पर एक nutator (अवरुद्ध) पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
   
   
5. पीबीटी में प्राथमिक एंटीबॉडी के एक उपयुक्त कमजोर पड़ने को तैयार. इस नमूने के अनुसार की 0.5ml की जरूरत है. उदाहरण के लिए, मैं खरगोश विरोधी सी cadherin PAB 1 / 200 कमजोर पड़ने का इस्तेमाल करने के लिए 5mm प्लास्टिक वर्गों में सी cadherin के subcellular स्थानीयकरण का अध्ययन.
   
   
6. अवरुद्ध समाधान Aspirate और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 0.5ml जोड़ने. एक स्टायरोफोम ट्यूब धारक पर खड़ा स्थिति में शीशियों रखो. 4 º सी में एक nutator पर रातोंरात सेते हैं.
   
   
7. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (इस पतला प्राथमिक एंटीबॉडी और बचाया जा सकता है और अगले 1-2 हफ्तों में reused है) निकालें. आरटी में 4 बार (40-60 मिनट प्रत्येक) के लिए पीबीटी के 4.5ml के साथ धोएं.
   
   
8. 0.5ml बायोटिन - संयुग्मित पीबीटी में माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 / 100 के कमजोर पड़ने के साथ विनिमय. 4 º सी में एक nutator पर रातोंरात सेते हैं. कवर एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीशियों प्रकाश से बायोटिन की रक्षा.
   
   
9. इस बिंदु से, देखभाल से प्रकाश, यानी नमूना रक्षा करने के लिए, कुछ कवर या एल्यूमीनियम पन्नी के तहत शीशियों रखने के लिए लिया जाना चाहिए.
   
   
10. बायोटिन माध्यमिक एंटीबॉडी (यह भी अगले 1-2 हफ्तों में reused किया जा सकता है) निकालें. के साथ या पीबीटी का 4 बार के लिए 4.5ml (40-60 मिनट प्रत्येक) आरटी पर धो लें.
    
    
11. 0.5ml 1 / 200 (FITC, टेक्सास लाल, आदि) fluorescently लेबल पीबीटी में streptavidin के कमजोर पड़ने के साथ विनिमय. 4 º सी में एक nutator पर रातोंरात सेते हैं.
    
    
12. (यह reused किया जा सकता है भी) streptavidin निकालें. आरटी - 3 बार के लिए धो पीबीटी के 4.5ml के साथ (30 मिनट प्रत्येक 15).
    
    
13. आरटी पर 30 मिनट के लिए 3.7% एफए + पीबीएस के 4.5ml में भ्रूण फिक्स.
    
    
14. पीबीएस के 4.5ml के साथ दो बार धोएं.
    
    
15. नमूना निर्जलीकरण. इथेनॉल का एक वर्गीकृत श्रृंखला में सेते हैं, के रूप में इस प्रकार है:
    
    

    30% EtOH / एच 2 हे	10 मिनट
    50% EtOH / एच 2 हे	10 मिनट
    75% EtOH / एच 2 हे	10 मिनट
    100% EtOH	10 मिनट

    
    
    
16. नमूना 4 º सी में यह प्रकाश से बचाने के कवर के साथ 100% EtOH में संग्रहीत किया जा सकता है.

घुसपैठ

1. Technovit 7100 घुसपैठ मिश्रण बनाओ. मैं आमतौर पर एक 50ml शंक्वाकार ट्यूब में आधार तरल के 15ml ले hardener के 150mg मैं जोड़ने और इसे 15 मिनट के लिए एक nutator पर घोड़ा द्वारा मिश्रण. यह घुसपैठ मिश्रण 4 ° C में रखा जा सकता है एक महीने के लिए.
   
   
2. घुसपैठ मिश्रण के साथ Technovit घुसपैठ कॉम्बो / मिश्रण EtOH के एक वर्गीकृत श्रृंखला के साथ आदान प्रदान नमूना घुसपैठ के रूप में निम्नानुसार है:
   
   
   1. 50% / Technovit EtOH - 1 घंटा
      
      
   2. 100% Technovit - 1 घंटा
      
      
   3. 100% Technovit - रात भर
      
      
3. specimen 100% की घुसपैठ के लिए मिश्रण में संग्रहीत किया जा सकता है 4 º सी. पर एक महीने के लिए उन्हें प्रकाश से बचाने के नमूने पर एक कवर रखो.

एम्बेड

1. Technovit 7100 एम्बेडिंग मिश्रण बनाओ: एक 1.5ml ट्यूब में घुसपैठ मिश्रण के 0.75ml ले लो और 50ml hardener द्वितीय जोड़ने. यह inverting ट्यूब कई बार द्वारा मिक्स.
   
   
2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग लेने के लिए, एक नमूना 0.5ml पतली दीवार पीसीआर ट्यूब में रातोंरात घुसपैठ की. सतह पर तैरनेवाला के सबसे निकालें.
   
   
3. एम्बेडिंग इस अनुभाग के कदम # 1, "एम्बेड" नमूना करने के लिए, में बनाया मिश्रण के 0.25ml जोड़ें. ओरिएंट bisected भ्रूण विच्छेदन ट्यूब के नीचे का सामना करना पड़ रहा विमान, धीरे से एक टिप सुस्त विच्छेदन सुई (विच्छेदन सुई लकड़ी संभाल) के साथ परोक्ष दबाव डाल.
   
   
4. टोपी बंद करें और लगभग चार घंटे के लिए एक अंधेरी जगह में ट्यूब सेते प्लास्टिक polymerize करने की अनुमति.
   
   
5. Technovit 3040 मिश्रण बनाओ. एक वजन पकवान पाउडर का 1 ग्राम ले लो, और तरल के 0.5ml जोड़ें. तत्काल, पाउडर और तरल एक bluetip का उपयोग मिश्रण. कठोर spacimen के शीर्ष पर डालो. यह पीले Technovit 3040 ट्यूब से बाहर आने से पूरे प्लास्टिक ब्लॉक को रोकने जाएगा.

सेक्शनिंग

1. Xylene के साथ Histoknife एच पोछो (EtOH अक्सर काफी अच्छा नहीं है) और इसे अपने सूक्ष्म तक्षणी पर सेट. लगभग 45 ° पर ब्लेड कोण. Xylene के साथ ब्लेड के सामने मंच क्षेत्र पोछो, भी, क्योंकि इस क्षेत्र की पवित्रता sectioned स्लाइस की गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण है.
   
   
2. ट्यूब की ओर कट और एक गत्ता चाकू का इस्तेमाल बंद टिप छील.
   
   
   
   
3. सूक्ष्म तक्षणी के चक धारक में नमूना सेट.
   
   
4. एक स्लाइड गिलास पर एक "प्रेस करने के लिए सील" सिलिकॉन विसंवाहक संलग्न अनुभाग स्लाइस के लिए एक बढ़ते कक्ष बनाने के लिए. मजबूती से साफ benchtop पर स्लाइड करने के लिए विसंवाहक प्रेस और दूसरी तरफ से देखने को यकीन है कि विसंवाहक किसी भी हवा - बुलबुले के बिना पूरी तरह जुड़ा हुआ है. स्लाइड पर एक पाश्चर विंदुक का उपयोग पूल करने के लिए स्वच्छ और गर्म _{DH 2} हे (~ 40 डिग्री सेल्सियस) डालो, स्तर जहां यह देखा जा सकता है कि पानी की सतह फ्लैट, नहीं अवतल या आकार में उत्तल हो जाता है.
   
   
5. अनुभाग स्लाइस बनाने शुरू करो. Immunofluorescence पढ़ाई के लिए, मैं 5 मिमी अनुभाग स्लाइस बनाते हैं. स्वस्थानी संकरण नमूनों में के लिए, स्लाइस की मोटाई की सीमा ~ 3 में समायोजित किया जा सकता है - 8 मिमी, उद्देश्य और संकेतों की तीव्रता पर निर्भर करता है.
   
   
6. ब्लेड के सामने मंच से पानी के साथ बढ़ते चैम्बर अनुभाग स्लाइस कैर्री एक छोटे तूलिका का उपयोग कर. पानी के पूल के शीर्ष पर एक टुकड़ा के साथ तूलिका पकड़ो और टुकड़ा यह एक टिप सुस्त विच्छेदन सुई के साथ दस्तक द्वारा ड्रॉप - डाउन पानी के लिए. टुकड़ा एक गोल आकार में विस्तार के रूप में जल्द ही के रूप में यह पानी की सतह हिट.
   
   
7. जब बढ़ते चैम्बर के पानी की सतह क्षेत्र के सबसे अनुभाग स्लाइस के साथ भरा है, ऊपर चूसना एक पाश्चर विंदुक का उपयोग पानी के लगभग आधे. एक स्लाइड गर्म नमूना पूरी तरह से सूखे बनाने रातोंरात पर स्लाइड सेते हैं.
   
   
8. काउंटर DAPI (ते में 0.1mg/ml) के पांच मिनट के लिए 1ml के साथ दाग. Aspirate DAPI और नमूना सूखी.
   
   
9. स्लाइड से सिलिकॉन रबर विसंवाहक निकालें. अब नमूने के चित्र लिया जा सकता है है. 4 में नमूना स्टोर ° सी, प्रकाश से संरक्षित.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na2HPO4·7H2O 0.2 g KH2PO4The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H2O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H22O	Buffer
50% EtOH/H2O	Buffer
75% EtOH/H2O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.