Biology

Incorporare plastica e Sezionamento embrioni di Xenopus laevis

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Sezioni di plastica mantenere morfologia vero tessuto in sezioni sottili di tessuto che può essere immunoistochimica con anticorpi secondari fluorescenti, rendendo questo metodo più utile di sezioni in paraffina o congelati per molti tipi di tessuto. Il metodo per la colorazione, di inclusione, e sezionamento è dimostrato in questo video.

Protocol

Fissazione

Trasferimento degli embrioni intero o sezionato in espianti MEMFA o 3,7% FA + PBS in una piccola fiala di vetro scintillazione (cat Fisher # 03-339-25B). Incubare fiala sul nutator a temperatura ambiente, solo per 2 ore, e non di più. Non lasciare l'embrione in FA per più di 2 ore. Più a lungo di incubazione in FA renderà più difficile il tessuto embrionale e determinare una scarsa penetrazione di anticorpi nel processo di rilevamento.
Aspirare la maggior parte delle FA e aggiungere fissativo Dent fino alla cima del flaconcino (~ 4,5 ml). Capovolgere delicatamente il flaconcino per un paio di volte per lavare gli embrioni a Dent, lo scambio con un altro di 4,5 ml di Dent fresca, e incubare in -20 ° C per almeno 48 ore. Durante la notte non è sufficiente. Questo passo rende gli embrioni più permeabile per l'anticorpo. Gli embrioni possono essere mantenute in questo stato per diverse settimane.

Immunofluorescenza

Reidratare il campione. Incubare in una serie graduata di metanolo, come segue:

75% MeOH / H ₂ O 10min
50% MeOH / PBS 10min
25% MeOH / PBS 10min
PBS 10min
PBS 10min
Fai agarosio 1,5% / PBS piastre con 60 millimetri piatti di plastica. Versare PBS in cima alla agarosio dopo è diventato solido.
Emi-sezionamento degli embrioni: Mettere gli embrioni in un 1,5% di agarosio / PBS piatto. Afferra un embrione con un paio di pinze e tagliare a metà il centro di un embrione con una lama sottile di rasoio. Scegli quelli che sei riuscito a tagliare a metà con un piano di taglio dritto.
Trasferimento degli embrioni divisa in due in un flaconcino di vetro scintillazione con PBT. Scambio con 4,5 ml di siero di capra 20% + PBT. Incubare a RT per 2 ore su una nutator (blocco).
Preparare una diluizione appropriata di anticorpi primari in PBT. 0,5 ml di campioni per questo è necessario. Per esempio, ho usato la diluizione 1 / 200 di coniglio anti-C-caderina pab per studiare la localizzazione subcellulare di C-caderina nelle sezioni 5 millimetri di plastica.
Aspirare la soluzione di saturazione e aggiungere 0,5 ml di anticorpo primario diluito. Mettere le fiale in posizione di stand-up su un supporto tubo di polistirolo. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator.
Rimuovere l'anticorpo primario diluito (questo anticorpo primario diluito possono essere salvate e riutilizzate nelle prossime 1-2 settimane). Lavare con 4,5 ml di PBT per 4 volte (40-60 minuti) a temperatura ambiente.
Scambio con 0,5 ml di diluizione 1 / 100 di biotina-anticorpo secondario coniugato in PBT. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator. Coprire le provette con un foglio di alluminio per proteggere dalla luce biotina.
Da questo punto, occorre prestare attenzione per proteggere il campione dalla luce, cioè, tenere i flaconi sotto qualche coperchio o foglio di alluminio.
Rimuovere la biotina-anticorpo secondario (questo può essere anche riutilizzato nei prossimi 1-2 settimane). Lavare con o 4,5 ml di PBT per 4 volte (40-60 minuti) a temperatura ambiente.
Scambio con 0,5 ml di 1 / 200 di diluizione di fluorescenza marcata (FITC, Texas-rosso, ecc) streptavidina in PBT. Incubare per una notte a 4 ° C su un nutator.
Rimuovere la streptavidina (questo può essere riutilizzato, anche). Lavare con 4,5 ml di PBT per 3 volte (15 - 30 minuti ciascuno) a temperatura ambiente.
Fissare gli embrioni in 4,5 ml del 3,7% FA + PBS per 30 minuti a temperatura ambiente.
Lavare con 4,5 ml di PBS due volte.
Disidratare il campione. Incubare in una serie graduata di etanolo, come segue:

30% EtOH / H ₂ O 10 min
50% EtOH / H ₂ O 10 min
75% EtOH / H ₂ O 10 min
100% EtOH 10 min
Il campione può essere conservato in EtOH 100% a 4 ° C con un coperchio per proteggerlo dalla luce.

Infiltrazione

Fai Technovit 7100 mix infiltrazione. Di solito prendo 15 ml di liquido di base in un tubo da 50 ml conica, aggiungere 150 mg di I e indurente da mescolare a dondolo su un nutator per 15 minuti. Questo mix infiltrazione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese.
Infiltrarsi nel campione con la miscela infiltrazione attraverso lo scambio con una serie graduata di infiltrazione Technovit mix / EtOH combo, come segue:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 ora
2. Technovit 100% - 1 ora
3. Technovit 100% - pernottamento
Il specimen possono essere memorizzati nel mix infiltrazione del 100% fino ad un mese a 4 ° C. Mettere un coperchio sui campioni per proteggerli dalla luce.

Incorporare

Fai Technovit 7100 mescolare incorporare: Prendere 0.75ml del mix di infiltrazione in un tubo di 1,5 ml e aggiungere 50 ml di indurente II. Mescolare invertendo il tubo diverse volte.
Utilizzando una pipetta di plastica trasferimento, prendete un campione infiltrati durante la notte in 0,5 ml sottile parete del condotto di PCR. Rimuovere la maggior parte del supernatante.
Aggiungere 0,25 ml della miscela incorporare fatto al punto 1 di questa sezione, "Incorporamento", per il campione. Orientare l'embrione diviso in due per fare il piano di dissezione di fronte alla parte inferiore del tubo, spingendo delicatamente con un sordo-punta dell'ago dissezione (in legno con impugnatura ago dissezione).
Chiudere il coperchio e incubare la provetta in un luogo buio per circa quattro ore per consentire la plastica polimerizza.
Fai Technovit 3040 mix. Prendere 1 grammo di polvere di una capsula, e aggiungere 0,5 ml di liquido. Immediatamente, mix in polvere e liquido utilizzando un bluetip. Versare sopra la spacimen indurito. Questo giallo Technovit 3040 impedirà l'intero blocco di plastica che esce dal tubo.

Sezionamento

Pulire Histoknife H con xilene (EtOH spesso non è abbastanza buono) e metterlo sul vostro microtomo. Angolo della lama a circa 45 °. Pulire l'area palco davanti alla lama con xilene, anche perché la pulizia di questa zona è fondamentale per la qualità delle fette sezionato.
Tagliare il lato del tubo e la buccia di punta off con un coltello di cartone.
Impostare il campione nel porta mandrino del microtomo.
Fissare un isolante "Premere-per-seal" silicio su un vetrino per fare una camera di montaggio per le fette sezione. Premere con decisione l'isolatore alla diapositiva sul banco di lavoro pulito e guardare dall'altra parte per assicurarsi che l'isolante sia completamente inserito, senza bolle d'aria. Versare pulite e calde dH ₂ O (~ 40 ° C) alla piscina sul vetrino con una pipetta Pasteur, fino al livello in cui si può notare che la superficie dell'acqua diventa piana, concava o convessa non in forma.
Iniziare a fare fette sezione. Per gli studi di immunofluorescenza, faccio 5 fette sezione mm. Per i campioni di ibridazione in situ, lo spessore delle fette può essere regolato nel range di ~ 3 - 8 mm, a seconda dello scopo e le intensità dei segnali.
Trasportare le fette sezione dal palco davanti alla lama alla camera di montaggio con acqua, usando un pennello di piccole dimensioni. Tenere il pennello con una fetta in cima alla piscina di acqua e rilascia la fetta fino al mare battendo con un sordo-punta dell'ago dissezione. La fetta si espanderà in una forma circolare non appena colpisce la superficie dell'acqua.
Quando la maggior parte del territorio delle acque superficiali della camera di montaggio è pieno di fette di sezione, succhiare quasi la metà dell'acqua utilizzando una pipetta Pasteur. Incubare il vetrino in una notte più calda per fare scivolare il campione completamente asciutto.
Counter-macchia con 1 ml di DAPI (0.1mg/ml in TE) per cinque minuti. Aspirare DAPI e asciugare il campione.
Rimuovere l'isolante in gomma di silicone dalla diapositiva. Ora le foto possono essere prese del campione. Conservare il campione a 4 ° C, al riparo dalla luce.

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.